SDSPAGE電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量

1、SDS-PAGE 電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私?SDS-PAGE 垂直板型電泳法的基本原理及操作技術(shù)。學(xué)習(xí)并掌握 SDS PAGE 法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理SDS-PAGE 電泳法，即十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳法，。1在蛋白質(zhì)混合樣品中各蛋白質(zhì)組分的遷移率主要取決于分子大小和形狀以及所帶電荷多 少。2在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，加入一定量的十二烷基硫酸鈉（SDS ），SDS 是一種陰離子表面活性劑， 加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)， 并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上 （在 一定條件下， 大多數(shù)蛋白質(zhì)與 SDS 的結(jié)合比為 1.4gSDS/1g 蛋白質(zhì)） ，使各種蛋

2、白質(zhì) SDS 復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷， 其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量， 從而掩蓋了 不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。 此時(shí)， 蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量 大小，而其它因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎可以忽略不計(jì)。3.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值呈直線關(guān) 系，符合下列方程：1gMr =K bmR式中：Mr為蛋白質(zhì)的分子量；K為常數(shù)；b為斜率；mR為相對(duì)遷移率。在條件一定時(shí)，b和K均為常數(shù)。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)

3、曲線上求得分子量。叩小用r(b)勺用蚩?jī)?nèi)烷用臨甌咬 失柱悶坡竭片Z間.耒知蛋白SWIC4；電泳分離蛋白儀器、原料和試劑儀器：垂直板型電泳槽；直流穩(wěn)壓電源；50或100卩1微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽；燒杯；吸量管；常頭滴管等。原料：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白0.51mg - ml-1樣品溶解液配制?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。試劑：(1) 分離膠緩沖液(Tris-HCI緩沖液 PH8.9 ):取1mol/L鹽酸48mL , Tris 36.3g,用無(wú)離子 水溶解后定容至100mL。(2) 濃縮膠緩沖液(Tris-HCI緩沖液 PH6.7 ):取1moI/L鹽酸

4、48mL, Tris 5.98g,用無(wú)離子 水溶解后定容至100mL。(3) 30%分離膠貯液：配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰胺( Acr)30g及N , N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至 100ml，過(guò)濾后置棕色試劑瓶中， 4 C 保存。(4) 10%濃縮膠貯液：稱 Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL ,過(guò)濾 后置棕色試劑瓶中，4 C貯存。(5) 10%SDS溶液：SDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解。(6) 1%TEMED ;(7) 10%過(guò)硫酸銨(AP ):現(xiàn)用現(xiàn)配。(8) 電泳緩沖液(Tris-甘氨酸緩沖液 P

5、H8.3 ):稱取Tris 6.0g,甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用無(wú)離子水溶解后定容至1L。(9 )樣品溶解液：取 SDS 100mg，巰基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚藍(lán)2mg , 0.2mol/L , pH7.2磷酸緩沖液0.5mL，加重蒸水至10mL (遇液體樣品濃度增加一倍配制)。用來(lái)溶解 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測(cè)固體。(10 )染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán) G-250 ,加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。(11 )脫色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。實(shí)驗(yàn)步驟1 .安裝夾心式垂直板電泳槽：目前，夾心式垂直板電泳槽有很多型號(hào)，雖然設(shè)置略有

6、不同，但主要結(jié)構(gòu)相同，且操作簡(jiǎn)單，不易泄漏。同學(xué)們可根據(jù)具體不同型號(hào)要求進(jìn)行操作。主要注意：安裝前，膠條、玻板、槽子都要潔凈干燥；勿用手接觸灌膠面的玻璃。2 配膠：根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)分子量范圍，選擇適宜的分離膠濃度。本實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE不連續(xù)系統(tǒng)，按下表的配制分離膠和濃縮膠。試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量 /ml配制10ml濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液(30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分離膠緩沖液(pH8.9Tris-HCI )2.502.502.502.50-濃縮膠貯液(10%Acr-0.5%Bis )-3.

7、0濃縮膠緩沖液(pH6.7 Tris-HCl )-1.2510% SDS0.200.200.200.200.101%TEMED2.002.002.002.002.00重蒸餾水11.8710.208.545.204.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min10%AP0.100.100.10I10.100.053 制備凝膠板：（1 ）分離膠制備：按表配制 20ml 10%分離膠，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將凝膠液加至長(zhǎng)、短 玻璃板間的縫隙內(nèi)，約 8cm高，用1ml注射器取少許蒸餾水，沿長(zhǎng)玻璃板板壁緩慢注入， 約3 4mm高，以進(jìn)行水封。約 30min后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表 示凝膠完

8、全聚合。傾去水封層的蒸餾水，再用濾紙條吸去多余水分。（2）濃縮膠的制備：按表配制10ml 3%濃縮膠，混勻后用細(xì)長(zhǎng)頭滴管將濃縮膠加到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約0.5cm處，輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，避免帶入氣泡。約 30min后凝膠聚合，再放置 20 30min。待凝膠凝固，小心拔去樣品槽模 板，用窄條濾紙吸去樣品凹槽中多余的水分，將pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒(méi)過(guò)短板約 0.5cm以上，即可準(zhǔn)備加樣。4 .樣品處理及加樣各標(biāo)準(zhǔn)蛋白及待測(cè)蛋白都用樣品溶解液溶解，使?jié)舛葹?.51mg/mL，沸水浴加熱3分鐘,冷卻至室溫備用。處理好的樣品液如經(jīng)長(zhǎng)期存放

9、，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1分鐘，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。一般加樣體積為10 - 15譏（即2 10進(jìn)蛋白質(zhì)）。如樣品較稀，可增加加樣體積。用微量注射器小心將樣品通過(guò)緩沖液加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內(nèi)都加了樣品，即可開(kāi)始電泳。5 .電泳將直流穩(wěn)壓電泳儀開(kāi)關(guān)打開(kāi)，開(kāi)始時(shí)將電流調(diào)至10mA。待樣品進(jìn)入分離較時(shí)，將電流調(diào)至20 - 30 mA。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至底部時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)閉電源。拔掉固定板，取 出玻璃板，用刀片輕輕將一塊玻璃撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。6染色及脫色將染色液倒入培養(yǎng)皿中，染色 1h 左右，用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色，直到蛋白

10、區(qū) 帶清晰，即用直尺分別量取各條帶與凝膠頂端的距離。計(jì)算1.相對(duì)遷移率 mR = 樣品遷移距離（ cm ） /染料遷移距離（ cm ）2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)待測(cè)樣品相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其分子量。注意事項(xiàng)1. 不是所有的蛋白質(zhì)都能用 SDS- 凝膠電泳法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方 法測(cè)出的分子量是不可靠的。 包括： 電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)， 帶有較大輔基的蛋白質(zhì) （如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1 ，它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的 SDS ，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子 量是21,000，但SDS-凝膠電泳測(cè)定的結(jié)果卻是 35,000。因此，最好至少用兩種方法來(lái)測(cè) 定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。2 .有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白） 或兩條以上肽鏈（如 a胰凝乳蛋白酶） 組成的， 它們?cè)?SDS 和巰基乙醇的作用下， 解離成亞基或單條肽鏈。 因此，對(duì)于這一類蛋白質(zhì)， SDS- 凝膠電泳測(cè)定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。 為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測(cè)定其分子量及分子中肽