黃岡師范學(xué)院2018年度-2018年度第二學(xué)年分子實(shí)驗(yàn)的考試問題詳解

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案2011 2012學(xué)年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)期末考試試卷答案一簡答題1. 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理是什么？DNA分子帶負(fù)電荷，在電場中受到電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)向正極移動(dòng)過程中，因DNA分子的大小及構(gòu)象差別而呈現(xiàn)遷移位置上的差異，對(duì)于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比，電泳時(shí)加溴化乙錠，其與DNA結(jié)合形成一種熒光絡(luò)合物，在254365nm 紫外照射下可產(chǎn)生桔紅色的熒 光，可用于檢測DNA。（此法可觀察到凝膠中2ng左右的DNA ）。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，當(dāng)其加熱到沸點(diǎn)后再冷卻凝固就形成良好的 電泳介質(zhì)，其孔徑?jīng)Q定于其濃度。電泳介質(zhì)中的孔徑對(duì)電泳遷移中的帶電分

2、子產(chǎn) 生一種阻力，阻力的大小取決于帶電分子的大小及其物理性狀。因此，瓊脂糖可制成不同孔徑的凝膠，分離 DNA的范圍廣，約200bp50kb。在一定電場強(qiáng)度下，若無任何介質(zhì)阻礙遷移，則大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在實(shí)際電泳中，由于使用了瓊脂糖分子篩介質(zhì)，對(duì)大分子DNA產(chǎn)生了較強(qiáng)的阻力，因此大分子 DNA盡管有較高的帶電量，仍難以快速前進(jìn)；小 分子DNA由于能夠穿越介質(zhì)網(wǎng)孔，其帶電量盡管相對(duì)較小，但仍能快速遷移到 正極。因此，不同的DNA分子在瓊脂糖凝膠中產(chǎn)生了不同的遷移距離，這種遷 移距離的差異使得不同大小 DNA得以分離。2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？EB即溴

3、化乙錠。因?yàn)殇寤义V含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的 飽和溶液中，大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其 平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與 DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率 比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而 被結(jié)合的染料本身吸收302nm 和366nm 的光輻射。這兩種情況下，被吸收的 能量在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物 的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合

4、DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴 化乙錠（0.5ug/ml ）時(shí)，可以檢測到少至10ng的DNA條帶。3制備基因組DNA時(shí)用到的以下試劑（CTAB、巰基乙醇、氯仿、無水乙醇、70 %乙醇）分別起什么作用？CTAB :溶解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；巰基乙醇：抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，能保護(hù)DNA ;另外巰基 乙醇能消除CTAB在震蕩過程中產(chǎn)生的大量氣泡；氯仿：去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等，純化 DNA ；無水乙醇：沉淀DNA ；70 %乙醇：漂洗并沉淀DNA。4. 什么是感受態(tài)細(xì)菌？感受態(tài)細(xì)菌的主要作用？感受態(tài)細(xì)菌：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)

5、稱感受態(tài)細(xì)菌。主要作用：感受態(tài)的細(xì)菌適于攝取和容納外來 DNA。再者，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn) 入感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，不僅可以檢驗(yàn)重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受 態(tài)細(xì)菌作為重組載體的宿主可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如蛋白質(zhì)表達(dá)純化等工作。5. 簡單敘述質(zhì)粒DNA提取過程中加入各種試劑后分別會(huì)產(chǎn)生什么現(xiàn)象，簡要解釋為什么？溶液I :現(xiàn)象不明顯。菌體重懸于溶液中。溶液U:管底出現(xiàn)沉淀物質(zhì)。溶液II使菌體裂解、蛋白質(zhì)變性，管底就會(huì)出現(xiàn)一 些細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)沉淀物。溶液III :沉淀增加。乙酸鉀能使SDS產(chǎn)生不溶水的沉淀并將蛋白質(zhì)和染色體沉 淀下來。氯仿：異戊醇（24:1 ）現(xiàn)象待考溶解蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)無水乙醇

6、（作用：沉淀DNA ）70 %乙醇（作用：漂洗并沉淀 DNA ）TE緩沖液（作用：溶解質(zhì)粒DNA ）注意：實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象自己對(duì)照實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫6藍(lán)白斑篩選的原理藍(lán)白斑篩選要篩選的是白班，因?yàn)榘装叽砟康幕蜣D(zhuǎn)入了大腸桿菌中， 藍(lán)斑表示沒有轉(zhuǎn)入。具體原理見下：藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子， 如a-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載 體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有B -半乳糖苷酶基因（lacZ）的 調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS ），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到B -半乳糖苷酶的氨基 端而不影

7、響功能，這種載體適用于可編碼B -半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì) 胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成 具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為a-互補(bǔ)。由a -互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌 落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源 DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可 避免地導(dǎo)致無a -互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌 落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。7.移液器的規(guī)范使用量程的調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)量程時(shí)，如

8、果要從大體積調(diào)為小體積，則按照正常的調(diào)節(jié)方法，逆時(shí) 針旋轉(zhuǎn)旋鈕即可；但如果要從小體積調(diào)為大體積時(shí)，則可先順時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度旋鈕 至超過量程的刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，這樣可以保證量取的最高精確度。在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否則會(huì)卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了 移液槍。槍頭（吸液嘴）的裝配在將槍頭（pipette tips ）套上移液槍時(shí)，很多人會(huì)使勁地在槍頭盒子上敲 幾下，這時(shí)錯(cuò)誤的做法，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件（如彈簧）因敲擊產(chǎn) 生的瞬時(shí)撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住。正確的方法是將移 液槍（器）垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)即可使其緊密結(jié)合。如果是 多道（如8道或1

9、2道）移液槍，則可以將移液槍的第一道對(duì)準(zhǔn)第一個(gè)槍頭，然 后傾斜地插入，往前后方向搖動(dòng)即可卡緊。槍頭卡緊的標(biāo)志是略為超過0型環(huán),并可以看到連接部分形成清晰的密封圈。移液的方法移液之前，要保證移液器、槍頭和液體處于相同溫度。吸取液體時(shí)，移液器 保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下 2-3毫米。在吸液之前，可以先吸放幾次液 體以潤濕吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度與水不同的液體時(shí)）。這時(shí)可以采取 兩種移液方法。一是前進(jìn)移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停點(diǎn)，然后慢慢松開按鈕回原 點(diǎn)。接著將按鈕按至第一停點(diǎn)排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)吹出殘 余的液體。最后松開按鈕。二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘

10、液體、生物活性液體、易起泡液體 或極微量的液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體，轉(zhuǎn)移液體的時(shí)候不用 吹出殘余的液體。先按下按鈕至第二停點(diǎn)，慢慢松開按鈕至原點(diǎn)。接著將按鈕按 至第一停點(diǎn)排出設(shè)置好量程的液體，繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點(diǎn)（千萬別再 往下按），取下有殘留液體的槍頭，棄之。移液器的正確放置使用完畢，可以將其豎直掛在移液槍架上，但要小心別掉下來。當(dāng)移液器槍 頭里有液體時(shí)，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。維護(hù)保養(yǎng)時(shí)的注意事項(xiàng)如不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保 護(hù)彈簧。最好定期清洗移液槍，可以用肥皂水或 60 %的異丙醇，再用蒸餾水清

11、洗， 自然晾干。高溫消毒之前，要確保移液器能適應(yīng)高溫。校準(zhǔn)是可以在20-25度環(huán)境中，通過重復(fù)幾次秤量蒸餾水的方法來進(jìn)行。使用時(shí)要檢查是否有漏液現(xiàn)象。方法時(shí)吸取液體后懸空垂直放置幾秒中，看 看液面是否下降。如果漏液，原因大致有一下幾方面：1、槍頭是否匹配；2、彈簧活塞是否正常；3、如果是易揮發(fā)的液體（許多有機(jī)溶劑都如此），則可能是飽和蒸汽壓的問 題?？梢韵任艓状我后w，然后再移液。二論述題1.答：1）如果該目的基因?yàn)橐阎颍倚蛄幸阎?，貝U通過數(shù)據(jù)庫查到基因序 列，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR獲得全長，凝膠回收后，與載體連接、轉(zhuǎn)化、 挑單克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA，測序驗(yàn)證。2）如果該目的基因?yàn)?/p>

12、新材料中的基因，且序列未知，則可通過數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 同源基因序列搜索，比對(duì)分析，根據(jù)同源性高的部分設(shè)計(jì)引物，PCR獲得片段，測序得到部分序列，根據(jù)已知的部分序列設(shè)計(jì) GSP引物，利用RACE分別獲得 5'及3 '端序列，測序拼接成全長序列，再根據(jù) 1）步的步驟獲得該目的基因。關(guān)鍵技術(shù)：引物設(shè)計(jì)，利用堿基互補(bǔ)原理，注意引物Tm值、GC%含量、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、錯(cuò)配等。連接、轉(zhuǎn)化，利用 Taq酶反應(yīng)加A的特性， 與T載體可以互補(bǔ)，連接。轉(zhuǎn)化，則是利用a互補(bǔ)顯色反應(yīng)原理，對(duì)陽性克隆進(jìn) 行篩選。注意連接時(shí)目的片段與載體的摩爾比為5: 1-10 : 1, 一般16度過夜連接，轉(zhuǎn)化時(shí)注意感