細(xì)胞工程知識(shí)點(diǎn)陳永勤

1、細(xì)胞工程知識(shí)點(diǎn)陳永勤第一章 植物組織培養(yǎng)簡(jiǎn)介1. 細(xì)胞工程（ Cell Engineering ）：在體外對(duì)生物的細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)與分化的調(diào)控、遺傳重組與 改良，使其生產(chǎn)出人類所需要的產(chǎn)品。驗(yàn)證細(xì)胞全能性假說(shuō)是開展植物組2. 細(xì)胞全能性假說(shuō)是開展植物組織培養(yǎng)研究的理論基礎(chǔ)； 織培養(yǎng)研究的動(dòng)力。/生長(zhǎng)素的比3. 細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度比值決定著愈傷組織根或芽的形成。細(xì)胞分裂素 值： 高：形成芽；低：形成根；相當(dāng)：愈傷組織增殖，但不分化。4. 植物組織培養(yǎng)在植物性狀改良上的應(yīng)用: 胚培養(yǎng)可克服遠(yuǎn)源雜交不孕的困難； .花藥（花粉）培養(yǎng)可大大縮短育種年限； .原生質(zhì)體融合技術(shù)可克服有性雜交不親和，創(chuàng)造遠(yuǎn)

2、源雜種、甚至新的物種； .單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可用于突變體的篩選。第二章 植物組織培養(yǎng)的設(shè)施1. 培養(yǎng)室所需要的設(shè)備： .培養(yǎng)架 :培養(yǎng)架的設(shè)計(jì)既要考慮充分利用培養(yǎng)室的空間，也要考慮取放材料方便。 .加溫 /降溫設(shè)備：空調(diào) 光照和控光設(shè)備。分為光培養(yǎng)室和暗培養(yǎng)室。光培養(yǎng)室常用日光燈照明，并安置控制光 照時(shí)間的自動(dòng)開關(guān)。2. 瓶蓋、瓶塞、或者封口膜的透氣性能對(duì)材料的培養(yǎng)有顯著影響，透氣性能不好的，容器中 濕度高（飽和） ，容易導(dǎo)致植物材料出現(xiàn)玻璃化（生理病態(tài)，植物材料呈水漬狀，深綠色， 剛脆，無(wú)繼續(xù)培養(yǎng)的價(jià)值）第三章 植物組織培養(yǎng)基1. 培養(yǎng)基的重要性 :1）植物材料生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源；2）調(diào)節(jié)植物材料生

3、長(zhǎng)與分化的主要途徑。2. 培養(yǎng)基的組成： .水：要求純凈。應(yīng)用蒸餾水、去離子水，而不用自來(lái)水。 .無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分：植物生長(zhǎng)發(fā)育需要有 16 種必需元素：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S ；微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn 。不同培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽（特別是大量元素）的濃度差異很大。 .有機(jī)營(yíng)養(yǎng)：有機(jī)營(yíng)養(yǎng)（有機(jī)成分） ：維生素和氨基酸的總稱。常用：肌醇、煙酸、維生素B6、維生素B1和甘氨酸等。其它維生素：維生素 M （葉酸）、維生素B2 （核黃素）、泛酸鈣等。 其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等 .碳源：最常用的糖是蔗糖（suc

4、rose），但也有時(shí)用葡萄糖（glucose）、果糖（fructose）或其它的 糖（lactose, maltose），有時(shí)幾種糖混用。糖是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但不是越多越好。培養(yǎng)基中糖的用量大多在 10 60g/L, 般為 20 30 g/L。 植物生長(zhǎng)物質(zhì)：植物生長(zhǎng)物質(zhì)是植物激素和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的總稱。 植物激素：植物合成的、微量就有顯著生理效應(yīng)的物質(zhì)。 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：人工合成的、具有植物激素相似作用的物質(zhì)。 凝固劑：在植物組織培養(yǎng)中，瓊脂（agar）是最常用的凝固劑，用量為6-12g/L。另外還有 phytagel, Gelrite, 4g/L 。 有機(jī)附加物：水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、

5、胰蛋白胨、酵母提取物：用量為0.1-10g/L, 一般為 0.5-3 g/L。椰子汁：100-200ml/L。 其它物質(zhì)：防止與減緩植物材料褐化的物質(zhì)：1）抗氧化劑：抗壞血酸（Vc ）、L-半光氨酸、檸檬酸、二硫蘇糖醇等。2） 吸附劑：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。PVP 專一吸附酚類物質(zhì)?；钚蕴课綗o(wú)選擇性；改善培養(yǎng)效果、促進(jìn)生根。3植物激素在植物組織培養(yǎng)中的作用： 生長(zhǎng)素： （1） 促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖，導(dǎo)致愈傷組織的形成（2,4-DNAAIAA, IBA） ；（2） 控制器官的分化，誘導(dǎo)根的形成。（ IBANAAIAA） 細(xì)胞分裂素 :促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖，導(dǎo)致愈傷組織的形成；控制器官的

6、分化，誘導(dǎo)芽的形 成和增殖。 赤霉素 :赤霉素最顯著的作用是促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)，也有打破種子休眠的作用。在植物組織 培養(yǎng)中使用赤霉素主要是促進(jìn)芽或莖的伸長(zhǎng)。赤霉素對(duì)熱不穩(wěn)定，故不宜用高溫法消毒。，相反， 乙烯 :乙烯促進(jìn)果實(shí)成熟，加速植物衰老。植物組織培養(yǎng)極少使用乙烯（乙烯利） 而是盡量控制乙烯的產(chǎn)生。embryoid ）的 脫落酸 :脫落酸是促進(jìn)植物衰老的激素，植物組織培養(yǎng)很少用。在胚狀體（ 誘導(dǎo)和培養(yǎng)中常常使用脫落酸，促進(jìn)胚狀體的成熟。4植物激素母液的配制：對(duì)于生長(zhǎng)素類激素， 也可用稀堿助溶；對(duì)于細(xì)胞分裂素類激素， 可用 稀酸助溶。激素母液也應(yīng)在低溫下保存。5高溫消毒時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題： 一定要先

7、排氣10 min，否則不能消毒不徹底； 高溫消毒后，培養(yǎng)基的 pH值會(huì)下降0.20.5個(gè)pH單位； 高溫消毒過(guò)程中， 培養(yǎng)基中有些物質(zhì)會(huì)被破壞或發(fā)生沉淀。 如蔗糖會(huì)水解成葡萄糖和果糖， 葡萄糖變成葡萄糖酸等； 有些物質(zhì)甚至幾乎完全被破壞， 如赤霉素、玉米素等。物質(zhì)破壞程 度與消毒時(shí)間和壓力有關(guān)。6.過(guò)濾滅菌法：由于過(guò)濾消毒不會(huì)破壞培養(yǎng)基的成分和改變培養(yǎng)基的pH值，所以在原生質(zhì)體培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)常用過(guò)濾消毒法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。 如果培養(yǎng)基中要使用一些熱不穩(wěn)定 的物質(zhì)，如 ZT 、 GA3 、核黃素等，則這些物質(zhì)也要用過(guò)濾消毒法滅菌。第四章 外植體的表面消毒 外植體 （Explant） 用于建立

8、無(wú)菌培養(yǎng)的起始植物材料。表面消毒 （Surface sterilization） （用消毒劑）殺死外植體表面其它生物（主要是細(xì)菌和真 菌）的過(guò)程。1. 外植體表面消毒的必要性：植物材料表面都帶有細(xì)菌和真菌，如消毒不徹底，細(xì)菌和真菌 會(huì)在培養(yǎng)基中迅速生長(zhǎng)，占據(jù)空間、消耗營(yíng)養(yǎng)、分泌毒素，使植物材料死亡。因此，接種前 對(duì)外植體進(jìn)行有效的表面消毒是建立無(wú)菌培養(yǎng)的關(guān)鍵。2. 表面消毒的要求：（1）最大限度地殺死細(xì)菌和真菌（2 ）對(duì)外植體的毒害要盡可能的小3. 常用消毒劑：消毒劑消毒濃度消毒時(shí)間效果優(yōu)缺點(diǎn)乙醇70%-75%10S-5 min ,多1min 內(nèi)較差易清洗，但對(duì)材料傷害大。氯化汞0.1% -0

9、.2%5-30 min很好毒性大，難清洗，清洗不夠則對(duì)材料有 殘毒效應(yīng)。次氯酸鈉1%有效氯5-30 min較好易清洗，對(duì)材料的殘毒效應(yīng)小。雙氧水3%10-60 min一般易清洗，對(duì)材料的殘毒效應(yīng)小。4. 外植體的表面消毒消毒步驟： 用自來(lái)水將材料沖洗干凈。 將材料上的水擦干，并剪成適當(dāng)大?。ㄩL(zhǎng)短）的小塊（段）。 在70%-75%的乙醇中10-60 S,然后迅速轉(zhuǎn)入到其它消毒劑（氯化汞、次氯酸鈉）中，消毒劑中可加入少量表面活性劑（Tween 20或80、家用洗滌劑等），以增加消毒效果。 消毒結(jié)束后，將材料轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中漂洗2-8次； 將材料的傷口部分切去后，再將其切成適當(dāng)大小，及時(shí)接入到培養(yǎng)基中。

10、5. 材料內(nèi)部污染的控制。表面消毒不能殺死內(nèi)部的細(xì)菌，可嘗試下列方法： 用分生組織作為外植體； 在培養(yǎng)基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素、四環(huán)素等）； 盡量將材料切小，并且每接一個(gè)外植體就將接種工具消毒一次，避免交叉感染。第五章高等植物離體再生和無(wú)性繁殖 有性繁殖（Sexual propagation）:通過(guò)兩性細(xì)胞結(jié)合形成的種子進(jìn)行繁衍后代的方法叫有性繁 殖。因?yàn)榉敝丑w是種子，所以又稱種子繁殖。無(wú)性繁殖（Asexual propagation ）:通過(guò)植物體一部分（常是營(yíng)養(yǎng)器官，如芽、根、莖、葉等） 繁殖的方法，所以又稱營(yíng)養(yǎng)繁殖（ vegetative prop agation）。植物的無(wú)性繁殖

11、有分株、扌千插、 壓條和嫁接4種方法。植物離體再生（in vitro plantlet regeneration）：在離體條件下，植物外植體（根、莖、葉、花 等）形成完整植株。不定芽（adventitious bud）:從外植體不固定的位置形成的芽。體細(xì)胞胚胎發(fā)生（somatic embryogenesis）:指誘導(dǎo)植物體細(xì)胞形成體細(xì)胞胚（胚狀體）的過(guò)程。1. 無(wú)性繁殖的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：所繁殖的植株與母株的性狀一致；缺點(diǎn)：繁殖速度有限，特別是當(dāng)起始材料少時(shí)，不能快速推廣優(yōu)良植株；容易傳播病害。2. 植物離體再生的途徑：頂芽與側(cè)芽再生途徑；不定芽再生途徑；胚狀體再生途徑；擬原球 莖再生途徑。3.

12、植物離體無(wú)性繁殖的過(guò)程： 繁殖體的誘導(dǎo)（芽、胚性愈傷組織、 Plb ） 繁殖體的增殖； 植株再生（芽的生根、胚狀體形成與萌發(fā)、PIb分化植株） 小苗移栽 : 將再生植株由組培室移栽到溫室、田間。4. 頂芽與側(cè)芽再生途徑步驟： 選擇適當(dāng)?shù)闹l、莖段，消毒； 莖段培養(yǎng)（nodal culture ）或莖尖培養(yǎng)（shoot tip culture） ; 1-2 芽/段 促進(jìn)頂芽和側(cè)芽生長(zhǎng)，形成幼莖（shoot）; 幼莖生根、形成完整植株。（重復(fù) 2 和 3 ，可以大量繁殖植物）5. 頂芽和側(cè)芽再生途徑的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 頂芽和側(cè)芽是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中自然形成的， 發(fā)生變異的比率很低。 利用頂芽和側(cè) 芽途

13、徑繁殖植物時(shí)變異率最小，所繁殖出來(lái)的群體在性狀上能最大限度地與母株保持一致。 缺點(diǎn)：速度可能比較低，不能滿足要求。6. 頂芽和側(cè)芽再生途徑可能存在的問(wèn)題： 不是所有的植物都可以進(jìn)行莖段培養(yǎng)。只有莖能伸長(zhǎng)的植物（菊花、馬鈴薯、葡萄、木本 植物等）才可用法，節(jié)間短、蓮座狀的植物（如鳳梨、非洲菊、白菜等）則不能用。 繁殖效率比較低。（繁殖速率：側(cè)芽生長(zhǎng)率、生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)度（節(jié)數(shù) ） 側(cè)芽萌動(dòng)率高，但伸長(zhǎng)不好，影響增殖效率和生根。7. 不定芽再生途徑過(guò)程： 外植體的選擇與消毒； 不定芽的誘導(dǎo) （外植體既可以直接形成不定芽， 也可以先形成愈傷組織， 再由愈傷組織形 成形成不定芽） ； 芽的增殖 （莖段培養(yǎng)

14、或不定芽 ）； 不定芽的生根。8. 影響不定芽形成的因素： 植物種類和品種（基因）差異： 植物外植體形成不定芽的能力：草本植物大于木本植物；雙子葉植物大于單子葉植物。 即使同一種植物，品種之間往往也有很大的差異。 外植體的類型：同一株植物以不同的器官（根、莖、葉、花、果實(shí)、胚）作為外植體，其 形成不定芽的能力往往會(huì)有差異。特別是木本 外植體的生理狀態(tài)： 幼年期的外植體形成不定芽的能力大于成熟期的外植體， 植物。一株植物不同部位的成熟度與其到根部的距離呈正相關(guān)。9. 不定芽途徑的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：（ 1 ）取材料方便，可以不毀壞母株；（2）芽的增殖速度快，繁殖效率高。（3）是培育轉(zhuǎn)基因植物的重要途

15、徑。缺點(diǎn)：植株變異的幾率較大。10. 無(wú)根苗生根兩種類型：皮部生根型和愈傷組織生根型。 皮部生根型：根直接從無(wú)根苗基部莖的皮層處長(zhǎng)出。愈傷組織生根型：無(wú)根苗基部先形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成根。11. 影響無(wú)根苗生根的因素： 植物的類型和品種： 草本比木本易； 幼年期外植體形成的無(wú)根苗比成年期形成的無(wú)根苗容 易； 基本培養(yǎng)基成分： 不同培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度差異較大， 對(duì)生根的影響也比較大。 一般較低 的無(wú)機(jī)鹽有利于生根； 生長(zhǎng)素：有些植物可以在無(wú)激素的培養(yǎng)基上生根，但大部分則要求使用一定濃度的生長(zhǎng)素。在誘導(dǎo)生根方面，IBA NAA IAA。12. 胚狀體途徑植株再生的過(guò)程： 選擇合適的材料、

16、誘導(dǎo)胚性愈傷組織（能夠產(chǎn)生胚狀體的愈傷組織） 促進(jìn)胚性愈傷組織形成正常的胚狀體（球型胚、心型胚、魚雷型胚、子葉胚、成熟胚） 促進(jìn)胚狀體萌發(fā)成苗13. 影響胚狀體誘導(dǎo)的因素： 植物種類：不同種類植物形成胚狀體的能力差異很大。 外植體種類 外植體生理狀態(tài)： 幼年期外植體高于成年期外植體， 尤其是用合子胚及種子萌發(fā)的幼苗為 外植體，容易誘導(dǎo)成功。 植物激素：少數(shù)植物可以在無(wú)激素的培養(yǎng)基上形成胚狀體，如人參；大多數(shù)植物則需要在生長(zhǎng)素、 或細(xì)胞分裂素、 或生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素共同作用的誘導(dǎo)下才能形成胚狀體，但激素種類、組合、濃度因植物種類而異。 培養(yǎng)基成分：糖、NH4+、Ca2+濃度，氨基酸（特別是脯氨酸

17、）、水解酪蛋白等物質(zhì)有利于胚狀體的誘導(dǎo)；麥芽糖有利于胚的成熟。14. 原球莖（根狀莖）途徑是蘭花快速繁殖的最快途徑，其中原球莖（根狀莖）誘導(dǎo)的是蘭 花快速繁殖的關(guān)鍵。 原球莖（根狀莖）的誘導(dǎo)難易因蘭花的種類和外植體類型而異。以頂芽 和側(cè)芽為外植體容易成功，以葉片、根則較難。15. 組培苗的移栽： 煉苗：在培養(yǎng)室內(nèi)將瓶塞打開（一半或完全）2-3天，讓組培苗逐漸適應(yīng)培養(yǎng)容器外面的環(huán)境，增加角質(zhì)層和蠟質(zhì)層厚度，增強(qiáng)抵抗室外環(huán)境（特別是濕度）變化的能力。造成 洗苗：煉苗結(jié)束后，在清水中將附著在根上的瓊脂洗凈，否則移栽后根系容易生霉， 爛根、死苗。 移栽：組培苗要移栽入溫室或溫棚中。基質(zhì)要求疏松、透水、

18、透氣性能好（如蛭石、珍珠 巖、泥炭土等配成的基質(zhì)） ，最好要消毒。保持較高的濕度；遮蔭、降低光照；保持溫度相 對(duì)平穩(wěn)。16. 用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)無(wú)毒苗的步驟：感病植株的病毒鑒定； 感病植株的熱處理；分生組織的分離；病毒的檢測(cè)：血清免 疫、電鏡觀察、接種鑒定等；移栽后的隔離，保證原種無(wú)病毒。17. 植物離體繁殖技術(shù)的應(yīng)用：快速繁殖優(yōu)良品種； 無(wú)病毒優(yōu)良種苗生產(chǎn)； 挽救和繁殖瀕危植物； 離體保存植物資 源（離體種質(zhì)庫(kù)）；培育轉(zhuǎn)基因植物。第六章 植物細(xì)胞培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng) （Plant Cell Culture） ：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)彼此分離的細(xì)胞、 使之生長(zhǎng)、增殖或分化。 固體培養(yǎng) （solid

19、culture） ：在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞 ,也稱靜止培養(yǎng)。液體培養(yǎng)(liquid culture ):在運(yùn)動(dòng)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。又稱懸浮細(xì)胞培養(yǎng) (suspensioncell culture )。繼代培養(yǎng)(傳代培養(yǎng)；subculture):將培養(yǎng)物(芽、愈傷組織、細(xì)胞等)分成若干份，接種 到新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)增殖的過(guò)程。愈傷組織(callus):群無(wú)明顯組織分化、有分裂能力的細(xì)胞群(團(tuán))。分化 (differentiation) ：形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能相同的細(xì)胞變成形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能互不同的細(xì)胞的 過(guò)程。脫分化 (去分化； dedifferentiation) ：已分化、成熟的細(xì)胞失去原有的狀

20、態(tài)、重新恢復(fù)分裂能 力的過(guò)程。再分化 (redifferentiation) ：愈傷組織形成其它組織或器官的過(guò)程。 最低起始細(xì)胞密度( minimum initial cell density )：細(xì)胞能夠生長(zhǎng)、分裂的最低接種密度。 看護(hù)培養(yǎng)(nurse culture):將親本愈傷組織或高密度的懸浮細(xì)胞同低密度細(xì)胞一起培養(yǎng)，以 促進(jìn)低密度細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂的培養(yǎng)方法。微室培養(yǎng) (Culture in microchamber) ：利用玻璃或塑料制作的小室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)。 植板率(plate efficiency):每個(gè)平板中新形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)與每個(gè)平板中接種的細(xì)胞數(shù)百分比。 前體物質(zhì)( pre

21、cursor) 指某一代謝中間體的前一階段的物質(zhì)。誘導(dǎo)子( elicitor) 指能刺激細(xì)胞合成次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)。條件培養(yǎng)液( conditioned medium ) : 已經(jīng)培養(yǎng)過(guò)某種細(xì)胞的培養(yǎng)液(內(nèi)含該細(xì)胞分泌的活 性物質(zhì)，包括少量生長(zhǎng)因子)與一定比例新鮮培養(yǎng)液混合的培養(yǎng)液。毛狀根( hariy root, 發(fā)根) 植物的器官、組織或細(xì)胞在發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)下產(chǎn)生的細(xì)小、多 分枝的不定根。生物轉(zhuǎn)化 (Biotransformation) 利用酶或生物細(xì)胞(微生物、植物、動(dòng)物)對(duì)外源化合物進(jìn)行 結(jié)構(gòu)修飾。1. 細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：(1) 進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究；(2) 培育植物變異體： 有變異，才會(huì)

22、有選擇 ;(3) 生產(chǎn)有用化合物。2. 影響植板率的因素 :(1) 植物種類：生長(zhǎng)快、容易培養(yǎng)的植物(如大多數(shù)草本植物) ，其植板率高；相反，則低。(2) 細(xì)胞的生理狀況：用快速生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種，則植板率高。(3) 接種細(xì)胞密度：接種密度高，有利于細(xì)胞分裂，提高植板率，如煙草細(xì)胞。(4) 培養(yǎng)基成分：用營(yíng)養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基或條件化培養(yǎng)基，植板率高。(5) 培養(yǎng)方式：采用看護(hù)培養(yǎng)( nurse culture )是可以提高植板率。3. 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物質(zhì)研究的過(guò)程:(1) .選擇外植體、誘導(dǎo)愈傷組織；(2) . 通過(guò)含量分析、選擇高產(chǎn)細(xì)胞系；(3) . 研究培養(yǎng)條件 (達(dá)到高產(chǎn)、

23、穩(wěn)產(chǎn)) ；(4) . 建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、優(yōu)化培養(yǎng)條件 (達(dá)到高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)) ；(5). 小試；優(yōu)化培養(yǎng)條件(6). 中試 ;優(yōu)化培養(yǎng)條件(7). 大規(guī)模培養(yǎng)(8). 工業(yè)化生產(chǎn)；產(chǎn)品分離、純化。4. 提高次生代謝產(chǎn)物的方法：(1) 選擇高產(chǎn)細(xì)胞系；(2) 優(yōu)化培養(yǎng)基(次生代謝物的產(chǎn)量=細(xì)胞生長(zhǎng)量X細(xì)胞合成代謝物的能力)；(3) 飼喂前體物質(zhì)( precursor) ;(4) 使用誘導(dǎo)子( elicitor) ；(5) 改善培養(yǎng)條件 ；(6) 改進(jìn)培養(yǎng)方法 ；(7) 固定化細(xì)胞培養(yǎng)。5. 如何選擇高產(chǎn)細(xì)胞系：(1) 不同植物、不同單株、不同外植體( 2)對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行系統(tǒng)選擇： 細(xì)胞系在培養(yǎng)工程中，

24、細(xì)胞系會(huì)出現(xiàn)變異，通過(guò)持續(xù)選擇， 有可能不斷提高細(xì)胞系的生產(chǎn)能力。( 3)細(xì)胞誘變選擇細(xì)胞系( 4)細(xì)胞系遺傳改良：利用基因工程技術(shù)超量表達(dá)限速酶基因、阻斷或者改變基因表達(dá)， 提高細(xì)胞系合成次生代謝產(chǎn)物能力。6. 毛狀根的誘導(dǎo)過(guò)程： 外植體選擇和表面消毒； 根農(nóng)桿菌的活化與培養(yǎng)； 感染(5-30min);2-5 天)； 共培養(yǎng)(在無(wú)激素、有乙酰丁香酮的培養(yǎng)基上培養(yǎng) 毛狀根形成(在無(wú)激素、有抗生素培養(yǎng)基)7. 生物轉(zhuǎn)化用途：增加該化合物的生物活性；生產(chǎn)化學(xué)合成的中間體。生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中所發(fā) 生的化學(xué)反應(yīng)主要有氧化、 還原、 羥基化、 甲基化、 去甲基化、 糖基化、 ?；?、 異構(gòu)化等。2、有一株稀

25、有菊花，莖上長(zhǎng)有10 片葉?，F(xiàn)要用離體培養(yǎng)技術(shù)將其在 1 年( 12 個(gè)月)內(nèi)繁殖出 100 萬(wàn)株生根的組培苗，請(qǐng)寫出主要技術(shù)要點(diǎn)。MS+BA第二部：轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基(生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素大致濃度相同，比如 1mg/L+NAA 1mg/l ) 第三步：將上述愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基( MS+BA2mg/l+NAA0.1mg/l) 第四步：轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基( 1/2MS+BA0.1mg/l+NAA1mg/l) 要想獲得大量組培苗重復(fù)第二步或第三步(完)第七章 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交 體細(xì)胞雜交(somatic hybridization ):不同植物原生質(zhì)體(protoplast)(體細(xì)胞)

26、之間發(fā)生融合。1. 原生質(zhì)體培養(yǎng)的用途 :(1) 原生質(zhì)體是研究細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁的形成、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、大分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞過(guò)程與 機(jī)理等問(wèn)題的良好實(shí)驗(yàn)體系 ；(2) 原生質(zhì)體是轉(zhuǎn)基因的良好受體；(3) 原生質(zhì)體可以誘導(dǎo)融合。2. 分離原生質(zhì)體的步驟：(1) 植物材料的選擇 :選擇分裂能力強(qiáng)，甚至再生能力強(qiáng)的植物材料；(2 )酶解處理 :酶解液中一般含有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等三種酶， 濃度為 0.5-2.0%。 為了保持原生質(zhì)體的完整及其活力， 必須使原生質(zhì)體處于一個(gè)等滲環(huán)境中。 將植物材料放入 酶解液中、釋放出原生質(zhì)體。 (材料與酶解液的比例： 2-10g/100ml 酶解液 )(3)

27、過(guò)濾：酶解結(jié)束后，將酶解物通過(guò)孔徑為20-80 m的不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，除去未被酶解的組織塊和細(xì)胞團(tuán)。(4) 離心：濾液轉(zhuǎn)到離心管中在50 X g下離心5min。(5) 洗滌：離心結(jié)束后，棄去上清液，用培養(yǎng)基或者原生質(zhì)體洗液重新懸浮沉淀的原生質(zhì)體， 再離心，倒出上清液。如此反復(fù) 2-4 次，就可以將殘留的酶液去掉。(6) 純化：用含高濃度( 21%)蔗糖的培養(yǎng)基進(jìn)行離心、純化，完整的原生質(zhì)體漂浮在上清液 的上部。(7) 收集原生質(zhì)體。3. 影響原生質(zhì)體培養(yǎng)效果的因素：(1) 植物材料：用于分離原生質(zhì)體的植物材料對(duì)原生質(zhì)體后來(lái)培養(yǎng)的效果影響極大。不同 的植物、同一植物不同的品種， 其遺傳組成存在差異

28、， 原生質(zhì)體的培養(yǎng)效果也就必然有差異。 一般來(lái)說(shuō)，容易培養(yǎng)的植物、外植體，其原生質(zhì)體也容易培養(yǎng)，反之，亦然。草本比木本容 易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。(2) 培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基：不同植物原生質(zhì)體要求有不同的基本培養(yǎng)基。原生質(zhì)體培養(yǎng)基中的大量元素應(yīng)比愈傷組織培養(yǎng)基中的大量元素濃度低。另外較高Ca2+濃度的對(duì)原生質(zhì)體分裂有利。 有機(jī)成分： 同培養(yǎng)細(xì)胞、 愈傷組織相比， 培養(yǎng)原生質(zhì)體時(shí)要求培養(yǎng)基有更豐富的有機(jī)成分。 大量的結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺有利于原生質(zhì)體的分裂。 激素：培養(yǎng)基中要加入一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。 條件化培養(yǎng)基：使用條件化培養(yǎng)基可以大大促進(jìn)原生質(zhì)體的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成

29、。 養(yǎng)基中的滲透壓： 原生質(zhì)體無(wú)細(xì)胞壁， 所以培養(yǎng)基中必須使用滲透壓調(diào)節(jié)劑(甘露醇、山 梨醇等)，以維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。4. 原生質(zhì)體融合有哪些方法 ?(1) 化學(xué)誘導(dǎo)法 :化學(xué)誘導(dǎo)法是利用一些化學(xué)物質(zhì) ,最常用的是聚乙二醇法和高鈣高pH 法。通過(guò)消除原生質(zhì)體表面的電荷， 促進(jìn)原生質(zhì)體彼此靠近、 接觸， 并能促進(jìn)接觸處的細(xì)胞膜發(fā)生 融解，從而實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體融合的。(2) 物理方法 :在電融合儀上進(jìn)行的。通過(guò)高頻( 500K Hz-2MHz )電場(chǎng)脈沖處理原生質(zhì)體，可 以使接觸處的原生質(zhì)體發(fā)生膜穿孔，最終導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。5. 植物體細(xì)胞雜交存在的問(wèn)題 :裂、分化和再生，更難得到同時(shí)(1) 再生困

30、難：不同原生質(zhì)體容易融合，但體細(xì)胞雜種難分 表現(xiàn) 2 個(gè)植物性狀的個(gè)體。(2) 遺傳物質(zhì)丟失：不同原生質(zhì)體之間存在嚴(yán)重排斥(3) 植株穩(wěn)定性差。第八章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)=貼壁現(xiàn)象。貼壁生長(zhǎng)：細(xì)胞需要緊貼培養(yǎng)容器內(nèi)壁才能生長(zhǎng)的現(xiàn)象 貼附型細(xì)胞：依賴貼附才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 接觸抑制：當(dāng)貼附培養(yǎng)容器內(nèi)壁生長(zhǎng)的細(xì)胞增殖到彼此緊密接觸時(shí)，細(xì)胞停止分裂、增殖。 懸浮型細(xì)胞：在培養(yǎng)過(guò)程中不貼附于培養(yǎng)容器表面、成游離狀的細(xì)胞。細(xì)胞系 (cell line) ：原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后所形成的細(xì)胞群。細(xì)胞株（Cell Strain）:從一個(gè)細(xì)胞系中由單細(xì)胞培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法由單細(xì)胞增殖形成的、 具有穩(wěn)定特殊性質(zhì)

31、或標(biāo)志的細(xì)胞群。干細(xì)胞（Stem Cell）:一種未充分分化、尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織、器官和個(gè)體的 潛在功能。1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)合成培養(yǎng)基：含合成培養(yǎng)基、血清和抗生素。（1）合成培養(yǎng)基：主要成分是氨基酸（13種以上）、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其他成分（如生長(zhǎng)因子、激素、貼壁因子等）（2 ）血清：非常重要，尤其是在細(xì)胞建立或細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛后再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。（3 ）抗生素：青霉素，鏈霉素 -防止感染。2. 血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的作用： 補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或量不足的營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)物、脂類物質(zhì)、核 酸衍生物

32、等； 提供細(xì)胞生存和增殖所必需的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子和激素； 含有一些可供貼壁細(xì)胞型細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的成分：如貼附因子；脂質(zhì)、金屬離子 提供載體蛋白：結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，可結(jié)合維生素、 等。 中和有毒物質(zhì)的毒性、保護(hù)細(xì)胞不受傷害； 提供良好的緩沖系統(tǒng)； 提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受死細(xì)胞釋放的蛋白酶的傷害。4. 培養(yǎng)細(xì)胞的生命期：（1 ）原代培養(yǎng)養(yǎng)物。特點(diǎn)：體內(nèi)的狀態(tài)。（2 ）傳代培養(yǎng)3. 動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞培養(yǎng)的比較： 相同：培養(yǎng)離散的細(xì)胞1動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞、組織細(xì)胞、組織、器官和個(gè)體培養(yǎng)周期大多生命周期較短，不能無(wú)限期培養(yǎng)可以長(zhǎng)期培養(yǎng)培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價(jià)格高，比較專一較簡(jiǎn)單

33、、成分一般明確，培養(yǎng)條件37 C, pH 7.2-7.4 ,5% 二氧化碳25 C, pH 5.4-5.8培養(yǎng)環(huán)境容易污染，環(huán)境條件要求非常潔凈潔凈組織和器官進(jìn)行的第一代培 能最大程度地反映細(xì)胞在（Primary culture）期：指直接從機(jī)體取出的細(xì)胞、 剛剛離體的細(xì)胞，其生物性狀尚未發(fā)生很大變化,（subculture）期：原代培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層會(huì)合以后，將其分散，按一定的比例轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。（3）衰退期（decline phase）:細(xì)胞傳代一定次數(shù)后，逐漸失去增殖能力，最后衰老、死亡， 這個(gè)時(shí)期為衰退期。原因復(fù)雜，最主要的原因是無(wú)法完全模擬體內(nèi)的條件，導(dǎo)致細(xì)

34、胞退化。5. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方法：懸滴培養(yǎng)法（微室培養(yǎng)） ；培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法；培養(yǎng)板培養(yǎng)法； 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法；灌注小室（perfusion chamber ）培養(yǎng)法。6. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用：（1 ）研究細(xì)胞生物學(xué)、分析基因功能的有效手段。（2）毒性及安全性分析：用于各種化學(xué)、物理、生物因素對(duì)機(jī)體的毒性實(shí)驗(yàn)及其產(chǎn)生不良影響的安全性調(diào)查。（3）診斷孕早期胎兒性別和遺傳疾?。河醚蚰ご┐绦g(shù)獲得的羊水中胎兒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn) 前檢測(cè)出多種代謝病與遺傳病，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。（4）藥物的研發(fā)與生產(chǎn)：動(dòng)物細(xì)胞是藥物篩選的首要模型，對(duì)新藥篩選、疫苗的研制、基 因工程藥物的開發(fā)具有決定性意義。（5）作為生物反應(yīng)器，廣泛用于人用和家禽家畜用的疫苗、生長(zhǎng)激素、多肽等生化藥物的 生產(chǎn)。（ 6 ）再生組織、器官，為組織、器官移植提供供體。第九章 動(dòng)物細(xì)胞融合 細(xì)胞融合（ cell fusion ）：通過(guò)誘導(dǎo)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程稱為細(xì) 胞融合；如果 2個(gè)不同的細(xì)胞進(jìn)行融合，則稱為細(xì)胞雜交（ cell hybridization ）。同核體（homokaryon）：由同一動(dòng)物個(gè)體的