蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)3 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)一、目的1、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。2、學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法。3、加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。1、 了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。二、原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的PH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽(yáng)極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)各有特異的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測(cè)其溶解度最低時(shí)的溶液pH值

2、。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同pH溶液中的溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋怼５鞍踪|(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。（1）可逆的沉淀反應(yīng) 此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來(lái)溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用

3、此類反應(yīng)。（2）不可逆沉淀反應(yīng) 此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來(lái)溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固。蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。三、材料、試劑與器具（一）材料新鮮雞蛋（二）試劑1、0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液 200ml取0.4g酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細(xì)地研磨，將所得的蛋白質(zhì)懸膠液移入200mL錐形瓶?jī)?nèi)，用少量4050的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶?jī)?nèi)。加入10mL 1mol/L醋酸鈉溶液。把錐形瓶放

4、到50水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶?jī)?nèi)的溶液全部移到100mL容量瓶?jī)?nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。2、1.00mol/L 醋酸溶液 100mL3、0.10 mol/L醋酸溶液 300mL4、0.01 mol/L醋酸溶液 50mL5、蛋白質(zhì)溶液 500mL5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清 ：水=1:9）6、pH4.7醋酸醋酸鈉的緩沖溶液 100mL7、3%硝酸銀溶液 10mL8、5%三氯乙酸溶液 50mL9、95%乙醇 250mL10、飽和硫酸銨溶液 250mL11、硫酸銨結(jié)晶粉末 10000mL12、0.1mol/L鹽酸溶液 300mL13、0.1m

5、ol/L氫氧化鈉溶液 300mL14、0.05mol/L碳酸鈉溶液 300mL15、甲基紅溶液 20mL（三）器具1、水浴鍋 2、溫度計(jì)3、200mL錐形瓶 4、100mL容量瓶5、吸管 6、試管及試管架 7、 乳缽四、操作步驟（一）酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定（1）取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別精確地加入各試劑，然后混勻。試管號(hào)蒸餾水（mL）0.01 mol/L蠟酸（mL）0. 1 mol/L蠟酸(mL)1. 0 mol/L蠟酸(mL)18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6 （2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL， 加一管，搖勻一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH依

6、次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。（二）蛋白質(zhì)的沉淀及變性1、蛋白質(zhì)的鹽析 無(wú)機(jī)鹽（硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等）的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類濃度時(shí)，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過(guò)程。加蛋白質(zhì)溶液5mL于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混濁沉淀，加少量水，觀察是否溶解，為什么？將管內(nèi)容物過(guò)濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為

7、止。此時(shí)析出沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。2、重金屬離子沉淀蛋白質(zhì) 重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加3%硝酸銀溶液12滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？3、某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì) 取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻傾出清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。4、有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì) 取1支試管，加入2mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2mL95%乙醇。觀察沉淀的生成（如果沉淀不明顯，加點(diǎn)NaCl，混勻。5、乙醇引起的變性與沉淀 取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑： 試劑（mL）管號(hào)蛋白質(zhì)溶液0.1mol/L氫氧化鈉溶液0.1mol/L鹽酸溶液95%乙醇PH4.7緩沖溶液123111111111振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻向各管內(nèi)加入水8毫升，然后在第2，3號(hào)管中各加一滴甲基紅，再分別用0.1mol/L 醋酸溶液及0.05mol/L碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解