蛋白質(zhì)組學(xué)思考題答案

1、1.蛋白質(zhì)組學(xué)概念？蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，從蛋白質(zhì)整體水平上來認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)。2.蛋白質(zhì)分離純化的基本原則？（1）獲得盡可能多的樣品蛋白（2）不同的制備方法配合使用（3）制備的方法與后續(xù)研究相結(jié)合3.細(xì)胞破碎的方法有哪些？（1）溫和裂解方法：凍融，滲透，去污劑，酶消化法，勻漿法（2）強(qiáng)烈裂解方法：超聲波，玻璃珠，研磨法4.蛋白質(zhì)裂解液使用還原劑、去污劑及變性劑的作用分別是什么，熟悉經(jīng)常用到的試劑？（1）去污劑：有助于溶解膜蛋白質(zhì)，并有助于膜蛋白質(zhì)與脂類的分離。常用的有離子型去污劑（SDS），非離子型去污劑（TritonX-100），兩性離子去污劑(CHAPS)。（2）變性劑

2、：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。常用的有尿素和硫脲。（3）還原劑：用于還原二硫鍵或防止蛋白質(zhì)氧化，增加蛋白質(zhì)的溶解性。常用的有具游離巰基的巰基乙醇（ME），二硫蘇糖醇（DTT）和不帶電荷的三丁基膦（TBP）。5.蛋白質(zhì)裂解液中加入兩性電解質(zhì)的作用是什么？（1）起載體作用（2）捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性6.影響樣品制備的干擾物質(zhì)有哪些？（1）鹽（NaCl）（2）離子去污劑（SDS）（3）核酸、脂類及多聚糖（4）酚類復(fù)合物（5）不溶物質(zhì)7.實(shí)驗(yàn)時(shí)去除植物材料中酚類物質(zhì)的方法是什么？（1）還原狀態(tài)：通過氫鍵與蛋白結(jié)合；處理

3、方法：添加PVPP，形成多酚物（2）氧化狀態(tài)（醌）：發(fā)生共價(jià)結(jié)合；處理方法：添加還原劑 (DTT, 抗壞血酸, 亞硫酸鹽)8.凝膠的分子篩效應(yīng)？凝膠分離不同分子量大小的分子的特性稱為分子篩效應(yīng)。9.雙向電泳第一向進(jìn)行膠條水化時(shí)的兩種方式是什么？各有什么特點(diǎn)？（1）主動(dòng)水化：低電壓可以讓高分子量的蛋白更好地進(jìn)入膠條（2）被動(dòng)水化：蛋白自然地進(jìn)入膠條；用于高鹽濃度的蛋白樣品；水化后, 在電極處使用濾紙片除鹽，如果在水化前使用濾紙片會(huì)導(dǎo)致蛋白被吸附在濾紙片上10.雙向凝膠電泳的基本原理？2D-SDS-PAGE是兩種分離方法的結(jié)合（1）根據(jù)等電點(diǎn)用IEF分離蛋白質(zhì)（2）在聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)一步分離

4、聚焦的蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)的不同，第二向電泳根據(jù)分子質(zhì)量的不同分離蛋白質(zhì)11.雙向凝膠電泳的基本流程？(1)等電聚焦：標(biāo)記膠條樣品上樣及水化置于聚焦盤內(nèi)設(shè)定IEF電泳程序加礦物油覆蓋膠面(2)膠條平衡：先在含有SDS、還原劑DTT但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡，再在含碘乙酰胺的平衡液中平衡(3)SDS-PAGE：制膠樣品制備加緩沖液連接電源電泳(4)染色：染色液及脫色液的配制染色脫色12.雙向電泳中第一向到第二向進(jìn)行平衡過程的機(jī)理？平衡buffer 1：還原(將SS鍵轉(zhuǎn)化為SH)，DTT平衡buffer 2：烷基化物 (使每個(gè)SH均烷基化以防止SS鍵的重新形成),碘乙酰胺13.蛋白凝膠染色的方法有哪

5、些？各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？（1）考馬斯亮藍(lán)法優(yōu)點(diǎn)：選擇性地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，大大地降低了化學(xué)噪音，提高了靈敏度（2）膠體考染法優(yōu)點(diǎn)：考馬斯亮藍(lán)定量地與蛋白質(zhì)結(jié)合，可以準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)；缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)谷氨酸羧基側(cè)鏈不可逆的酯基化（酸催化下），使得肽譜數(shù)據(jù)失真（3）銀染法優(yōu)點(diǎn)：大大提高了靈敏度；擴(kuò)展了動(dòng)態(tài)線性范圍兼容質(zhì)譜（去除戊二醛后）；快速，方便缺點(diǎn)：銀離子可與半胱氨酸殘基結(jié)合；銀染試劑戊二醛和甲醛都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的-和-氨基烷基化，妨礙后續(xù)分析（4）SYPRO染料優(yōu)點(diǎn)：快速，靈敏，終點(diǎn)式染色易操作；動(dòng)態(tài)線性范圍廣，染色覆蓋范圍廣；不干擾后續(xù)分析。14.正相和反相液相色譜的區(qū)別？（1）正相色譜法：采用極性固定

6、相；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑，常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。（2）反相色譜法：一般用非極性固定相；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。15.分子離子、質(zhì)荷比定義？（1）分子離子：氣態(tài)分子失去一個(gè)電子所得的離子叫做分子離子。（2）質(zhì)荷比（m/z)：質(zhì)譜檢測(cè)的分子離子的質(zhì)量與其所帶電荷的比值。16.生物質(zhì)譜的基本原理是什么？分析樣品在特定的條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楦咚龠\(yùn)動(dòng)的離子，這些離子根據(jù)質(zhì)量/電荷比的不同在靜電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下得到分離，用特定的檢測(cè)器可以記錄不同質(zhì)荷比的各種

7、離子的相對(duì)強(qiáng)度并形成質(zhì)譜圖。17.生物質(zhì)譜儀由幾個(gè)主要部分組成？基本部分：（1）離子源（2）質(zhì)量分析器（3）檢測(cè)器，檢測(cè)由質(zhì)量分析器分離的離子其他部分：（1）復(fù)雜計(jì)算機(jī)（2）真空泵系統(tǒng)18.比較MALDI和ESI的異同點(diǎn)？MALDI離子源工作原理：(1)以脈沖方式使樣品離子化，從固相標(biāo)本中產(chǎn)生的離子，并在飛行管中測(cè)定分子量(2)將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，用激光照射晶體，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，導(dǎo)致基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相(3)樣品被包裹在基質(zhì)中，大部分激光能量被基質(zhì)的發(fā)色基團(tuán)首先吸收，從而保護(hù)了樣品分子的完整性

8、MALDI優(yōu)點(diǎn)：能夠耐受高鹽；具有較高的質(zhì)測(cè)上限；能分析混合物；敏感度為fmol；可發(fā)展為蛋白及核酸測(cè)序手段缺點(diǎn)：質(zhì)量分辨率500*；質(zhì)量測(cè)定精確度為± 0.1% ±0.01%；不能與液相色譜聯(lián)用ESI離子源工作原理：原理：樣品通過液流流動(dòng)（通常從HPLC）進(jìn)入離子源，穿過有持續(xù)高壓的不銹鋼錐體或進(jìn)樣針，隨著液流利開進(jìn)樣針樣品分散為細(xì)霧狀微滴。微滴含有肽離子以及HPLC流動(dòng)相組分（水、乙腈、醋酸等）。離子源進(jìn)一步從溶液組分中分離肽離子，將離子轉(zhuǎn)移到質(zhì)量分析器。ESI優(yōu)點(diǎn)：能與HPLC、CZE聯(lián)用；能形成多價(jià)離子，可更為準(zhǔn)確地測(cè)定分子量；質(zhì)量分辨率為2000以上*；可以直接從

9、水相觀察非共價(jià)復(fù)合物；敏感度為fmol pmol；質(zhì)量測(cè)定精確度為±0.01%缺點(diǎn)：在分析混合物時(shí)，多價(jià)離子形成會(huì)使結(jié)果分析比較困難；僅在低鹽（1mmol/L）條件下給出理想信號(hào)；樣品組成過于復(fù)雜時(shí)可能不產(chǎn)生信號(hào)信號(hào)19.肽質(zhì)量指紋圖譜是如何鑒定蛋白質(zhì)的？PMF原理：將由質(zhì)譜獲得的肽段實(shí)驗(yàn)質(zhì)量數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中已知蛋白的肽段理論數(shù)據(jù)對(duì)比已達(dá)到鑒定蛋白的目的。eg：蓖麻毒素（Ricin）MALDI-TOF質(zhì)譜的測(cè)定，得到Ricin的分子量為62925Da根據(jù)Ricin的肽質(zhì)量指紋圖譜，共檢出22條肽譜峰將這些肽片段的質(zhì)量數(shù)據(jù)用MASCOT搜索引擎在SwissProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PMF檢索2

10、1.什么是二級(jí)質(zhì)譜圖？二級(jí)質(zhì)譜圖：在一級(jí)質(zhì)譜圖中，選擇其中的一個(gè)峰，對(duì)其進(jìn)行CID過程，就得到一張二級(jí)質(zhì)譜圖。CID：碰撞誘導(dǎo)解離,是通過撞擊使得多肽的肽鍵斷裂的過程。22.目前鑒定蛋白質(zhì)磷酸化的主要技術(shù)手段有哪些？（1）抗體法：主要采用磷酸化蛋白質(zhì)抗體富集磷酸化蛋白；專一性強(qiáng)、效率高。（2）離子交換色譜：離子交換色譜的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合?？煞譃閺?qiáng)陽離子交換色譜和強(qiáng)陰離子交換色譜。23.金屬螯合色譜（IMAC)的主要技術(shù)原理是什么？（1）利用金屬離子與磷酸肽之間的特異性作用進(jìn)行分離（2）金屬離子種類不同，對(duì)象不同24.什么是定量蛋白質(zhì)組

11、學(xué)？常用的研究技術(shù)有哪些？（1）定量蛋白質(zhì)組學(xué)或多重蛋白質(zhì)組學(xué)：是將一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量（相對(duì)定量）和鑒定的一門學(xué)科。（2）常用的研究技術(shù)：熒光差異凝膠電泳技術(shù)；穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)25.熒光雙向差異凝膠電泳與經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)的主要區(qū)別是什么？ 熒光雙向差異凝膠電泳（1）實(shí)驗(yàn)儀器：熒光染料、掃描儀、DeCyder分析軟件（2）靈敏度，實(shí)驗(yàn)時(shí)間：能檢測(cè)到小于10%的蛋白表達(dá)；（3）實(shí)驗(yàn)流程：經(jīng)典雙向電泳（1）實(shí)驗(yàn)儀器：IEF電泳儀、SDS-PAGE電泳儀、CCD照相機(jī)或激光密度掃描儀、PDQuest分析軟件（2）靈敏度，實(shí)驗(yàn)時(shí)間：（3）實(shí)

12、驗(yàn)流程：26.穩(wěn)定同位素標(biāo)記的基本原理是什么？（1）SILAC:細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素的氨基酸標(biāo)記SILAC的基本原理是：分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(重型)標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞經(jīng)5-6個(gè)倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。不同標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。（2）ICAT:同位素親和標(biāo)簽ICAT的基本原理是：利用同位素親和標(biāo)簽試劑預(yù)先選擇性地標(biāo)記含半胱氨酸的肽類，分離純化后通過質(zhì)譜進(jìn)行鑒定，根據(jù)質(zhì)譜圖上不同ICAT試劑標(biāo)記的一對(duì)肽段離子的強(qiáng)度比例，定量分析它的母本蛋白質(zhì)在原來細(xì)胞中的相對(duì)豐度。27.同位素親和標(biāo)簽（ICAT）技術(shù)的原理是什么？ICAT試劑由哪幾部分組成？作用分別是什么？ICAT試劑的組成和作用：（1）專一的化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)：能與蛋白質(zhì)的半胱氨