細(xì)胞生物學(xué)綜合性實驗

1、細(xì)胞生物學(xué)綜合性實驗課程名稱: 細(xì)胞生物學(xué)實驗姓 名: 李春輝班 級: 12級生科（1）班學(xué) 號: 2012041106時 間:植物原生質(zhì)體的分離、純化及融合引言 原生質(zhì)體是去除了細(xì)胞壁被質(zhì)膜所包圍的、具有生活力的/裸露細(xì)胞,對它的研究,可追溯到20世紀(jì)60年代英國植物學(xué)家Cocking1用酶解方法降解細(xì)胞壁,獲得了番茄根尖原生質(zhì)體,自此原生質(zhì)體的研究得到迅速的發(fā)展.1970年Nagata和Takeble2首次報道煙草葉肉原生質(zhì)體經(jīng)分離、培養(yǎng)得到再生植株.Carlson3于1972年利用原生質(zhì)體融合技術(shù)從煙草中獲得第一個種間雜種,可部分克服有性雜交不親和性,獲得體細(xì)胞雜種,從而為創(chuàng)造和選育優(yōu)良

2、品種找到了一條新途徑.近年來,由于原生質(zhì)體本身所具有的特點及其培養(yǎng)技術(shù)與有關(guān)的細(xì)胞、分子和遺傳等學(xué)科的交叉滲透,使植物原生質(zhì)體的研究越來越受到重視.研究領(lǐng)域也從分離原生質(zhì)體進(jìn)行的生理生化和利用不同材料的原生質(zhì)體得到再生植株的階段轉(zhuǎn)到原生質(zhì)體的應(yīng)用(尤其是遺性狀改良)方面.前人的研究表明,原生質(zhì)體不僅可以作為一個單細(xì)胞系統(tǒng)來研究細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂與分化、攝入細(xì)胞器、病毒侵染機理、膜透性及離子轉(zhuǎn)運等基礎(chǔ)理論研究的理想材料;而且,近年來以原生質(zhì)體為材料利用膜片鉗技術(shù)研究離子通道及原生質(zhì)體在受光、脅迫和激素作用后的調(diào)劑機制已經(jīng)成為人們所熱切關(guān)注的問題.與此同時,原生質(zhì)體也被用來作為研究植物細(xì)胞鈣信號

3、轉(zhuǎn)導(dǎo)及其調(diào)節(jié)機制的理想材料4,5.現(xiàn)在人們對利用原生質(zhì)體導(dǎo)入外源基因及原生質(zhì)體瞬間表達(dá)系統(tǒng)在基因研究中的應(yīng)用進(jìn)行了大膽的嘗試和實踐,目前已經(jīng)建立對芹菜、玉米、胡蘿卜、擬南芥和煙草等植物對不同的外界刺激下信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究6.這對植物遺傳轉(zhuǎn)化、性狀改良等方面都具有深刻的指導(dǎo)意義7,8.選擇分離原生質(zhì)體的適宜材料是分離原生質(zhì)體成功的關(guān)鍵9,主要包括基因型、材料的類型及材料的生理狀態(tài)等3個方面.基因型直接影響原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)效果.不同基因型分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力差別很大10,并直接影響原生質(zhì)體植株再生11,12.同時起始材料及其生理狀態(tài)對原生質(zhì)體的制備和活力的影響也很大13.葉片可以得到大量比較

4、均一的原生質(zhì)體且不使母細(xì)胞受到破壞,許多資料報道雙子葉植物分離原生質(zhì)體的最佳材料是葉片14.此外,子葉、胚軸、莖尖及愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物和體細(xì)胞胚等均可作為分離原生質(zhì)體的材料.在木本植物中,愈傷組織或細(xì)胞懸浮物是應(yīng)用最廣泛的原生質(zhì)體培養(yǎng)材料15.但是,采用愈傷組織和細(xì)胞懸浮物往往需要經(jīng)若干次的繼代培養(yǎng)才能達(dá)到適合分離原生質(zhì)體的狀態(tài);而繼代時間的長短在很大程度上影響所獲得原生質(zhì)體的活力和產(chǎn)量16.原生質(zhì)體的分離方法有機械法和酶解法兩種。機械分離法是19世紀(jì)末由Klercker首創(chuàng)的,其主要缺點是收獲量太小,但具有防止酶對原生質(zhì)體產(chǎn)生副作用的優(yōu)點。酶解分離法的優(yōu)越性是能得到大量有活力的原生質(zhì)體。由

5、于目前普遍采用的是酶解分離法,所以本實驗也采用酶解法。其原理是根據(jù)由纖維素酶、果膠酶和半纖維素酶配制而成的溶液對細(xì)胞壁成分的降解作用，而使原生質(zhì)體釋放出來。由于酶制劑中常含有核酸酶,影響原生質(zhì)體的活力,可以用降低保溫溫度或減少酶解時間,提高原生質(zhì)體的活力.實驗證明在原生質(zhì)體分離的混合酶液中加入一定量的CaCl2.2H2O、KH2PO4具有保護膜的作用17,加入適量的PVP或MES能穩(wěn)定酶解過程的pH值18.通常用甘露醇、山梨醇、葡萄糖來調(diào)節(jié)酶液的滲透壓.W.巴爾茨(1983)等19認(rèn)為,代謝活躍的滲透壓穩(wěn)定劑(葡萄糖和山梨醇)與代謝不活躍的滲透壓穩(wěn)定劑(甘露醇)一起使用有利于維持酶液的滲透壓.

6、酶解是在2528e的恒溫下黑暗或弱光下進(jìn)行的.酶解后經(jīng)過400目左右的鎳絲網(wǎng)過濾,濾去消解不完全的組織碎塊(導(dǎo)管、篩管等)和細(xì)胞團.然后將濾液離心,棄去上清液,將離心下來的原生質(zhì)體重新懸浮在洗液(CPW)中,再次離心,去上清液,重復(fù)3次.在倒置顯微鏡下檢查純化效果,效果好,用原生質(zhì)體培養(yǎng)基離心,效果不好,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的蔗糖離心,使完整的原生質(zhì)體浮于液面.原生質(zhì)體融合(protoplast fusion),亦稱細(xì)胞融合(cell fu-sion)體細(xì)胞雜交(somatic hybridization)超性雜交(para-sexual hybridization)或超性融合(parasexu

7、al fusion),是指不同種類的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段,在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過程20。原生質(zhì)體融合可避免受精作用中的種的特異性配子識別反應(yīng),有可能打破遠(yuǎn)親雜交中的有性不親和界限21。原生質(zhì)體技術(shù)還可用于種質(zhì)資源的保存、細(xì)胞突變體的篩選、細(xì)胞器移植和外源DNA的導(dǎo)入等方面。自1960年Cocking用酶法分離出番茄根原生質(zhì)體后22, Nagata等首次利用煙草葉分離原生質(zhì)體,經(jīng)培養(yǎng)獲得再生植株23; 1975年Vardi等首次從木本植物Shamonti甜橙珠心組織誘導(dǎo)胚性愈傷組織,并從愈傷組織分離原生質(zhì)體,經(jīng)培養(yǎng)通過胚狀體再生出植株24; 1985年Fu-jimura等率先在水稻原生質(zhì)

8、體培養(yǎng)中獲得了再生植株25,已從許多種內(nèi)、種間、屬間甚至亞科間的體細(xì)胞雜交獲得雜種細(xì)胞系或雜種植株。隨著多種植物原生質(zhì)體的成功培養(yǎng)和融合技術(shù)的不斷改進(jìn),植物細(xì)胞融合獲得了巨大成功。植物細(xì)胞融合技術(shù)包括原生質(zhì)體的制備、細(xì)胞融合的誘導(dǎo)、雜種細(xì)胞的篩選和培養(yǎng),以及植株的再生和鑒定等環(huán)節(jié)。原生質(zhì)體的融合方法經(jīng)歷了一個逐步改進(jìn)和完善的過程。在早期原生質(zhì)體融合的方法有NaNO3法、高pH/高Ca2+法、PEG(聚乙二醇)法,后來逐漸發(fā)展為PEG與高Ca2+、高pH相結(jié)合;20世紀(jì)80年代初又開始探索使用電融合法,并發(fā)展出一些其他方法。這些方法各有特點,但目前廣泛使用的是PEG法和電融合法。1974年高國楠

9、建立了PEG法,經(jīng)過不斷改進(jìn)已逐步走向完善,并得到廣泛應(yīng)用26,其融合頻率可達(dá)10%15%,無種屬特異性,幾乎可誘導(dǎo)任何原生質(zhì)體間的融合。在應(yīng)用PEG進(jìn)行融合時,重要的影響因素是PEG的種類、純度、濃度、處理時間、原生質(zhì)體的生理狀況和密度。近年來一些研究建議在PEG溶液中加入融合促進(jìn)劑(如伴刀豆球蛋白、二甲基亞砜等),可有效提高原生質(zhì)體的融合頻率。最近PEG誘導(dǎo)成對原生質(zhì)體融合的成功,使得PEG融合技術(shù)更精確化,并有可能免除雜種細(xì)胞的篩選27。1979年Senda建立的電融合法發(fā)展迅速,是目前最流行的融合方法28。但是電融合法需要昂貴的電融合儀,因此目前仍不如PEG法使用普遍。目前正在研究用電

10、腦控制進(jìn)行自動化操作,以提高操作效率。Li等29建立的激光融合法在融合煙草原生質(zhì)體時避免了親本原生質(zhì)體中葉綠體分布的影響,是近年來比較新的一種方法,但目前研究不多。本實驗采用PEG誘導(dǎo)融合法。1 材料、試劑與方法1.1 材料 菠菜葉片,唐古特白刺愈傷組織,金盞菊花瓣。1.2 試劑 （1）.70%酒精，5%的NaClO,滅菌蒸餾水， 0.2mol/LCaCl22H20 ，0.16mol/L CaCl2 * 2H2O溶液，并加有0.1%MES，PH5.8 6.2. （2）酶液A 纖維素酶(cellulase，Onozuka R-10 2 果膠酶(13ectinase，Serva) 1 % (若用國

11、產(chǎn)EA3-867纖維索酶，則果膠酶可省去。) 甘露醇 0.6 molL CaCl22H2O 0.05 molL MES 0.1 pH 5862 酶液B 纖維素酶(Onozuka R-10) 2 20%和12%的蔗糖溶液，PH5.86.2. 離析酶(Macerozyme R-10) 1 半纖維素酶(hemicellulase，Sigma) 0.2 甘露醇 0.4 molL CaCl22H20 0.1 MESPH5.86.2 （3）PEG溶液 30%（W/V）PEG (NW=6000) CaCl22H2O 10MOL/L KH2PO4 0.7MOL/L （4）高鈣稀釋液 CaCl22H2O 0.1

12、MOL/L 山梨醇 0.1MOL/L Tris緩沖液 0.05mol/L1.3 方法1.3.1 菠菜葉片和金盞菊花瓣的消毒處理 稱取1g葉片，自來水沖洗。然后用5%的次氯酸鈉浸泡10min，再用無菌水洗4次。1.3.2 原生質(zhì)體的分離 將葉片移入大培養(yǎng)皿中，用吸水紙吸去上面的水珠。然后將葉背面朝上，小心用鑷子撕去下表皮。將撕去下表皮后的葉片放進(jìn)預(yù)先放有酶液A的培養(yǎng)皿或帶蓋蘭角瓶中，每10ml酶液約放2g葉片。若葉片不易撕下下表皮，可用鋒利的解剖刀將葉片切成約0.5mm寬的小條，放入酶液。 將培養(yǎng)皿用石蠟?zāi)Х饪?，?8條件下保溫36h，中間輕輕搖動23 次。在倒置顯微鏡下檢查，直到產(chǎn)生足夠量的

13、原生質(zhì)體 。 1.3.3 原生質(zhì)體的純化 刻度離心管中，用600rmin的速度離心5min，使原生質(zhì)體沉淀下來。 用移液管吸去上清液。將沉淀的原生質(zhì)體懸浮在2ml 0.2 molL的CaCl22H2O中。用將酶解后的原生質(zhì)體懸浮液用不銹鋼網(wǎng)篩過濾到小燒杯中，以除去未酶解完全的組織。 將濾液分裝在注射糙生長針頭)向離心簧生部緩緩注入20蔗糖溶液6ml，在600rmin下離心5min。此步完成后，在兩相溶液的界面之間將出現(xiàn)一層純凈的完整原生質(zhì)體帶，雜質(zhì)，碎片將沉到管底。注射器吸出管底雜質(zhì)和下部的蔗糖溶液及上部的CaCI22H2O溶液。用5ml 0.16mol/LCaCl22H2O懸浮，在600rm

14、in下離心5min，保留沉淀。用3mLCaCI22H2O懸浮。1.3.4 原生質(zhì)體的融合 將收集到的不同材料的原生質(zhì)體用0.16moL/LCaCI22H2O懸浮。將兩種不同原生質(zhì)體等量混合。用吸管將混合的原生質(zhì)體混合液滴在60 的培養(yǎng)皿中，78滴，靜置10min,使其貼壁。用吸管將等量的PEG溶液滴在原生質(zhì)液滴上，靜置1015min。用刻度吸管向原生質(zhì)液滴緩慢加入高PH，高鈣稀釋液。第一次加入0.5mL，第二次加1mL，第三，四次各加2mL,每次間隔5min。平皿微斜，吸去上清液，緩緩加入4mL稀釋液，5min后吸去上清液。用MS培養(yǎng)基如上法洗2次，每次5min。1.3.5 原生質(zhì)體的培養(yǎng) 每

15、個平皿中加MS培養(yǎng)基4mL,輕輕搖動平皿。用蠟?zāi)っ芊馄矫?。?6下進(jìn)行24h暗培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)到弱光條件下培養(yǎng)。2 結(jié)果與分析 用聚乙二醇作為誘導(dǎo)劑的情況下，兩個植物細(xì)胞能夠融合，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞。兩細(xì)胞融合現(xiàn)通常分為五個階段。兩細(xì)胞膜接觸，粘連；細(xì)胞膜形成穿孔；兩細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)連通；通道擴大，兩細(xì)胞連成一體；細(xì)胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞。） 計數(shù)原生質(zhì)體的形成率：原生質(zhì)體形成率=原生質(zhì)體數(shù)/（原生質(zhì)體數(shù)+完整細(xì)胞數(shù)）100%3 討 論 從實驗結(jié)果我們可以看到，原生質(zhì)體融合的效率并不高，其原因有以下幾方面。3.1植物細(xì)胞原生質(zhì)體分離過程很重要，其分離質(zhì)量直接影響

16、后面融合的效率。因此，酶解分離時一定要注意把握時間的長短，時間過長，則細(xì)胞可能被破壞，融合時沒有細(xì)胞數(shù)量上的保證；如果酶解時間過短，則細(xì)胞壁不能被完全除去，也影響后面的融合效率。3.2 原生質(zhì)體融合 3.21 PEG的影響 1.分子量與濃度：細(xì)胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高，對細(xì)胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，實驗時常常采用的PEG分子量一般為10004000，濃度一般為40-60%。 2.PEG的PH值：經(jīng)驗證PEG的PH值在8.0-8.2之間融合效果最好。 3.PEG的處理時間：處理時間越長，融合效果越好，但對細(xì)胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限

17、制在1分鐘之內(nèi)。 4.融合時的溫度：由于生物膜的流動性與溫度成正比，故細(xì)胞融合的效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果，在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理溫度。 3.22 Ca2+ 的影響 Ca2+濃度對細(xì)胞融合有明顯的影響。所以在融合液中添加氯化鈣溶可促進(jìn)原生質(zhì)體融合。 參考文獻(xiàn)1 COCKING E C. Amethod for the isolation of plant protoplasts and vacuolesJ. Nature ,1960, 187:927-929.2 NAGATAT, TAKEBE I. Cellwall regeneration and c

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