培養(yǎng)基的制備試驗(yàn)報(bào)告

1、培養(yǎng)基的制備實(shí)驗(yàn)報(bào)告培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基（以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制為例） 的一般方法和原理。2. 了解消毒和滅菌的原理，掌握常用滅菌方法的操作步驟。實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng) 基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在 自然界中微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的 不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng) 含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長因素等。不同微生物對PH要求不一樣.雷菌和酵母的培養(yǎng)基的 pH般是偏酸性的，而細(xì)菌 和放線菌的培養(yǎng)基的pH 般為中

2、性或微堿性的（嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì) 菌例外 ）。所以配制培養(yǎng)基時(shí)，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基 的pH調(diào)到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器 等含有各種微生物，因此， 已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌如果來 不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)， 以防止其中的微生物生長繁殖而消耗養(yǎng)分 和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。高壓蒸氣滅菌是將持滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)， 通過加熱， 使滅菌鍋套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。 待水蒸氣急劇地將鍋 內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，此時(shí)由于 蒸氣不能道出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高 于100C的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝

3、固變性而達(dá)到滅菌的目的。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。 由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長繁 殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)， 所以可供作微生物生長繁殖之用。 基 礎(chǔ)培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和 NaCI。其中牛肉膏為微生物提供碳 源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素， 而NaCI 提供無機(jī)鹽。 在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量瓊脂作凝固劑， 瓊 脂在常用濃度下96C時(shí)溶化，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，一般在沸水浴中或下而 墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在 40C時(shí)凝固，通常不 被微生物分解利用。 固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫

4、 的不同而有所不同。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此要用稀酸或稀堿將其PH調(diào) 至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0g水 1000mlpH7.4 7.6實(shí)驗(yàn)儀器與藥品1.溶液或試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCI、瓊脂、1mol/L NaOH1molL HCl 。2.儀器或其他用具：試管、三角瓶、1000ml燒杯(或1000ml刻 度搪瓷杯)、量筒、玻棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽 滅菌鍋、pH試紙(pH 5.5-9.0 )、普通棉花、牛皮紙、記號筆、麻 繩、紗布等。實(shí)驗(yàn)步驟一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備1.

5、 稱量（假定配制 1000ml 培養(yǎng)基）按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 放入燒 杯（或 1000ml 刻度搪瓷杯）中牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯 或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量 后直接放人水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后 立即取出紙片。2. 溶化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約 700ml），用玻棒 攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水 到所需的總體積（1000ml）;如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂 放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。3. 調(diào) pH在未調(diào)pH前，先用

6、精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH,如果偏酸.用 滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH 試紙測其PH直至pH達(dá)747.6。反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。4. 過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾,以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察?？梢允∪ィū緦?shí)驗(yàn)勿需過濾 ） 。5. 分裝液體分裝分裝高度以試管高度的 14 左右為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需 要而定,一般以不超過三角瓶容積的一半為宜, 如果是用于振蕩培養(yǎng) 用,則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后,需要 補(bǔ)加一定量的其他無菌成分,如抗生素等,則裝量一定要準(zhǔn)確。固體分裝分裝試管,其裝量不超過管高的 15,滅菌后制成斜面。

7、分裝三 角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。半固體分裝般以試管高度的 1 3 為宜，滅菌后垂直待凝。6. 加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞 ( 或硅膠塞、 金屬或高溫塑料試管帽等 ) ，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)面造成 污染，并保證有良好的通氣性能 (棉塞制作方法附本實(shí)驗(yàn)后面 ) 。7. 包扎加塞后，將全部試管放入鐵絲筐或用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、 配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙， 用麻繩以活結(jié)形式扎好， 使用時(shí)容易解開， 同樣用記號筆注明培養(yǎng)基 名稱、配制日期。8. 滅菌將上述

8、培養(yǎng)基以0.103MPa 121 C, 20min高壓蒸氣滅菌。9. 擺斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50C左右（以防斜面上冷凝水太多），將 試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上， 擱置的斜面長度以不超 過試管總長的一半為宜l0. 無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入37 C的恒溫箱中培養(yǎng)24-48h .以撿查滅菌是否注意事項(xiàng)1. 蛋白胨很容易吸濕，在稱取時(shí)動作要迅速，另外，稱量時(shí)嚴(yán)防 藥品混雜一把牛角匙用于一種藥品或稱取一種藥品后，洗凈 擦干再稱職另一藥品瓶蓋也不要蓋錯。2. 在瓊脂溶化過程中應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容 器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅 或鐵鍋加熱溶化

9、，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。3. 對于有些要求PH較精確的微生物，其PH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn) 行（使用方法、可參考有關(guān)說明書）。pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而 影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制 pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí).若預(yù)先記 好PH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再 調(diào)整 pH。4. 分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管 （瓶）口上，以免沾污面 塞而引起污染。二）高壓蒸汽滅菌法步驟1. 加水使用前在鍋內(nèi)加入適量的水， 加水不可過少，以防將滅菌鍋燒干， 引起炸裂事故。 加水過多有可能引起滅菌物積水。 水面與三角架相

10、平 為宜2. 裝料將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。3. 加蓋蓋好鍋蓋，按對稱方法旋緊四周固定螺旋，打開排氣閥。4. 加熱排氣加熱后水蒸氣與空氣一起從排氣孔排出，待鍋內(nèi)沸騰并有大量蒸 汽自排氣閥冒出時(shí)， 排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)， 維持 23min 以排 除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣，應(yīng)適當(dāng)延長排氣時(shí)間，務(wù)必 使空氣充分排除，然后將排氣閥關(guān)閉。5. 加壓將排氣閥關(guān)閉6. 保壓當(dāng)壓力升至0.1MPa時(shí)，溫度達(dá)121 C，此時(shí)應(yīng)注意觀察，控制熱 源。保持壓力穩(wěn)定，維持 20-30min 后，切斷熱源。7. 自然降壓當(dāng)壓力表降至“ 0”處，稍停，使溫度繼續(xù)降至100C以下后，打 開排氣閥，

11、旋開固定螺旋，開蓋，取出滅菌物。注意：切勿在鍋內(nèi)壓 力尚在“0”點(diǎn)以上，溫度也在100C以上時(shí)開啟排氣閥，否則會因 壓力驟然降低，而造成培養(yǎng)基劇烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞， 以后培養(yǎng)時(shí)引起雜菌污染。壓力降到“ 0”時(shí)，方可打開排氣閥。8. 保養(yǎng)滅菌完畢取出物品后， 將鍋內(nèi)余水倒出， 以保持內(nèi)壁及內(nèi)膽干燥，蓋好鍋蓋。9.培養(yǎng)基無菌檢查 五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.要嚴(yán)格按配方配制。2.調(diào) pH 不要過頭。3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊， 注意溫度的時(shí)間控制， 70oC以下放物、取物。4. 高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時(shí)降壓回零取物。5. 過濾除菌要注意各部件滅菌，壓濾時(shí)

12、，壓力要適當(dāng)，不可太猛 太快，濾膜要注意清洗保存。陜西師范大學(xué)遠(yuǎn)程教育學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告報(bào)告題目 培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌姓 名學(xué) 號專業(yè)批次/ 層次指導(dǎo)教師 學(xué)習(xí)中心實(shí)驗(yàn)報(bào)告培養(yǎng)基的常規(guī)配置程序、目的要求1.掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2.掌握培養(yǎng)基的配置原則和方法。3.掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項(xiàng)。二、基本原理營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通 培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)胞生長繁殖所需要的最基本的 營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供細(xì)菌生長繁殖之用。高壓蒸汽滅菌：主要是通過升溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的效果。將滅 菌的物品放在一個

13、密閉和加壓的滅菌鍋內(nèi)， 通過加熱， 使滅菌鍋內(nèi)水 沸騰而產(chǎn)生蒸汽。 待蒸汽將鍋內(nèi)冷空氣從排氣閥中趨盡， 關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱。此時(shí)蒸汽不溢出，壓力增大，沸點(diǎn)升高，獲得高于100 C 的溫度導(dǎo)致菌體蛋白凝固變性，而達(dá)到滅菌的目的。三、實(shí)驗(yàn)材料1. 藥品：營養(yǎng)瓊脂、蒸餾水。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒 杯、量筒、錐形瓶、培養(yǎng)皿等。3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟一) 玻璃器皿的洗滌和包裝1 玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水 及蒸餾水沖凈。再置于烘箱中烘干后備用。2 滅菌前玻璃器皿的包裝1) 培養(yǎng)皿

14、的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，用報(bào)紙按傳統(tǒng)包月餅的方法，將幾套培養(yǎng)皿包成一包，準(zhǔn)備滅菌。2）移液管的包扎：先將報(bào)紙裁成寬約5cm的長紙條，然后將移液管尖端放在長條報(bào) 紙的一端，約成45C角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身, 右手將移液管壓緊。在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩 余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。3）無菌水的制備：往兩支潔凈的試管中分別加入 10ml 蒸餾水，用試管塞塞好，準(zhǔn)備滅菌。二）固體培養(yǎng)基的配制過程1 培養(yǎng)基配制（1）稱取4g營養(yǎng)瓊脂，溶于125ml的蒸餾水中，加熱使其完全 溶解。2）培養(yǎng)基的分裝分裝時(shí)，將 4 支洗凈的試管放置在試管架上，用 5ml 的移液管

15、分 別移取適量的上述溶液于試管中 （裝入量不宜超過試管高度的 1/5）；將剩余溶液倒入錐形瓶中（裝入量以錐形瓶總體積的一半為限度）， 用橡皮塞塞好瓶口。3）試管、錐形瓶的包扎將上述所有試管（包括盛裝無菌水的試管）捆成一捆。然后，將 捆好的試管與錐形瓶標(biāo)明組別與日期。4）培養(yǎng)基的滅菌將包扎好的玻璃器皿與捆好的試管與錐形瓶在高壓滅菌鍋中常壓， 121 C條件下滅菌20min。5）斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度（斜面長度不超過試管長度 l 2 為宜），凝固后即成斜面。 。6）平板的制作在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部，左手同時(shí)用小指和手掌將塞子

16、打開， 灼燒瓶口， 用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開縫，至瓶口正好伸入，將裝在錐形瓶中已滅菌的培養(yǎng)基， 待冷至50C 左右分別傾入1012ml培養(yǎng)基，于2個無菌培養(yǎng)皿中，迅速蓋好皿蓋, 置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿， 使培養(yǎng)基均勻分布于整個平皿中，冷凝后 即成平板。五、實(shí)驗(yàn)過程原始記錄營養(yǎng)瓊脂： 4g、4g 黃色營養(yǎng)瓊脂粉，完全溶于125ml 蒸餾水后，得到橙黃色的，透明的膠體溶液。、將營養(yǎng)瓊脂液按實(shí)驗(yàn)步驟操作，冷卻至室溫后， 即得到無色（略帶黃色）的膠狀培養(yǎng)基。六、結(jié)果及討論一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果成功的制備出了斜面和固體培養(yǎng)基，使后續(xù)細(xì)菌接種試驗(yàn)順利進(jìn)行。但仍存在些缺陷，有待改進(jìn)。1 、理論上，培養(yǎng)基分裝于試管后

17、，應(yīng)用棉塞封好試管口，且棉塞 的質(zhì)量好壞直接影響試驗(yàn)結(jié)果。但試驗(yàn)時(shí)，使用試管塞封口，由于試 管塞一般不透氣， 在滅菌的升溫和降溫過程中， 試管內(nèi)外壓力會有差 異，當(dāng)管內(nèi)壓力大于管外壓力時(shí)可能使塞子飛出或試管爆裂。 而棉花 塞透氣，能保持內(nèi)外壓平衡，且阻止細(xì)菌進(jìn)入。2 、動手能力差，有時(shí)不知所措；且操作粗心大意， 損壞玻璃器皿。二）、注意事項(xiàng)：1 、在瓊脂加熱溶解的整個過程用玻棒不斷攪勻， 防止瓊脂粘在燒 杯底部而使燒杯破裂；同時(shí)也使其充分溶解，避免培養(yǎng)基制作失敗，2、必要時(shí)可補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分至總體積。般情況下在配制固體培養(yǎng)基時(shí)，溶解的瓊脂液無須過濾。必 要時(shí)，可趁熱用 4 5 層紗布過濾。

18、3 、根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或錐形瓶內(nèi)，分 裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染，如操作不小心， 培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)， 可用鑷子夾一小塊脫脂棉， 擦去管口或瓶 口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。4 、平板制作時(shí)，將已滅菌的培養(yǎng)基待冷至50 C時(shí)傾入培養(yǎng)皿;若溫度過高時(shí)，則皿蓋上的冷凝水太多；反之，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。5 、滅菌時(shí)，以滅菌最 _ 而營養(yǎng)破壞最少，且方法最簡便為原則。加壓之前，冷空氣一定要完全排盡，以提高滅菌效果;恒溫滅菌時(shí)， 最好等自然使表壓減至“ 0”以后，才能打開滅菌鍋蓋。三）思考題回答1 、霉菌時(shí)，塞試管的棉塞是否可以用橡皮塞代替？為什么？

19、答：不可以，因?yàn)橄鹌と煌笟?，在滅菌的升溫和降溫過程中， 試管內(nèi)外壓力會有差異。 當(dāng)管內(nèi)壓力大于管外壓力時(shí)可能使塞子飛出 或試管爆裂。而棉花塞透氣，能保持內(nèi)外壓平衡，且能阻止細(xì)菌進(jìn)入。2 、如何檢查所配置的培養(yǎng)基無菌？若沒有滅菌，一定有菌。而有滅菌，則置于37 C恒溫箱中培養(yǎng), 兩三天觀察表面有無菌落形成。若無，證明培養(yǎng)基無菌，反之亦然。目的】了解選擇性培養(yǎng)基的原理，并掌撮配制選擇性培養(yǎng)基的方法和步 驟。概述】選擇性培養(yǎng)基是一類根據(jù)某微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ郴瘜W(xué)、 物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基， 具有使混合苗樣中的劣勢菌變成優(yōu) 勢菌的功能， 廣泛用于菌種篩選等領(lǐng)域。 選擇性培養(yǎng)基均含有增菌劑

20、 和選擇劑 Y 樣接種子這類培養(yǎng)基后，由于抑蔭劑的選擇性抑制作用 使所要分離的目的菌得到較好的繁殖， 而其他菌被抑制。 經(jīng)過一定的 培養(yǎng)時(shí)間后 . 再將目的菌接種到鑒別培養(yǎng)基上，可以提高目的菌的分 離陽性率。抑菌劑的種類很多， 如孔雀綠、煌綠、 _ 、去氧膽酸鈉、 膽鹽、四硫磺酸鈉或抗生素等，但加人量需準(zhǔn)確，有的可以水溶液無 菌配制冷藏備用。以上成分的用量、加人方法均按各類配方進(jìn)行。馬丁氏培養(yǎng)基常用于從自然環(huán)境中分離真菌，培養(yǎng)基中的去氧膽 酸鈉和鏈霉素不是微生物的營養(yǎng)成分。 由于去氧膽酸鈉為表面活性劑， 不僅可防止霉菌菌絲蔓延，還可抑制G一細(xì)菌生長，而鏈霉素對多數(shù)G細(xì)菌具抑制生長作用，所以它們

21、是用于抑制細(xì)菌和放線菌的生長,而對于真菌的生長則沒有影響，從而達(dá)到分離真菌的目的。Ashby 無氮培養(yǎng)基常用于從自然界環(huán)境中分離固氮菌。培養(yǎng)基中只含有基本的碳源和無機(jī)鹽， 沒有氮源。一般的細(xì)菌不能在此培養(yǎng)基生長，一些固氮的細(xì)菌可以利用空氣中的氮?dú)庾鳛榈矗?可以在此培養(yǎng)基上生長，從而達(dá)到分離固氮菌的目的。材料和器皿】(1)試劑: 蛋白胨，葡萄糖，甘露醇，孟加拉紅，鏈霉素，去氧膽酸鈉，KH2P04 MgS04 7H2O, NaC1, CaS04 2H2O CaC03 瓊脂。(2)器皿: 臺秤，燒杯，共角燒瓶，量筒，漏斗，試管，玻棒，加壓蒸汽滅菌鍋等。(3)其他：藥匙，pH試紙，稱量紙，記號筆，棉花塞，紗布，線繩,不銹鋼試管帽，牛皮紙，報(bào)紙等。方法和步驟】1. 馬丁氏培養(yǎng)基的配制(l) 培養(yǎng)基成分 :葡萄糖 10g蛋白胨 5gKH2PO4 1gMgS04 - 7H2O 0.5g0.1 孟加拉紅溶液 3.3ml瓊脂 16g蒸餾水 1000ml自然 PH2 %去氧膽酸鈉溶液20ml (預(yù)先滅菌，臨用前加入