PCR污染原因與檢測方法

1、PCR 污染原因與檢測方法PCR 反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題 是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。污染原因一、標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)， 由于密封不嚴(yán)溢于容器外， 或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染； 標(biāo)本核酸 模板在提取過程中， 由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染； 有些微生物標(biāo)本尤其是病 毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。二、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、 雙蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。三、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物污染： 這是 PCR 反應(yīng)中最主要

2、最常見的污染問題。 因?yàn)?PCR 產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml ），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限， 所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成 PCR 產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與 液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠， 在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管， 開蓋時(shí)、 吸樣 時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。 據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?48000 拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。四、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染： 在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對 照的檢驗(yàn)室， 這個(gè)問題也比較常見。 因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含

3、量相當(dāng)高， 另 外在純化過程中需用較多的用具及試劑， 而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒， 由于活細(xì)胞的 生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測， 考慮有無污染是什么原因造成的污染， 以便采取措施，防止和消除污染。對照試驗(yàn)一、陽性對照： 在建立 PCR 反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有 PCR 陽性對 照，它是 PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重 要的參考標(biāo)志。 陽性對照要選擇擴(kuò)增度中等、 重復(fù)性好， 經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的 標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（ 100 個(gè)拷貝以下）。但 陽性對照尤其是

4、重組質(zhì)粒及高濃度陽性標(biāo)本， 其對檢測或擴(kuò)增樣品污染的可能性 很大。因而當(dāng)某一 PCR 試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的 實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽性對照。二、陰性對照：每次 PCR 實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對照。它包括：1. 標(biāo)本對照： 被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照； 被檢的標(biāo)本是組 織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。2. 試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試 劑是否污染。三、重復(fù)性試驗(yàn)。四、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。防止污染的方法一、 污染的預(yù)防進(jìn)行 PCR 操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能 出現(xiàn)的 PCR 污

5、染或杜絕污染的出現(xiàn)。1. 劃分操作區(qū)：目前，普通 PCR 尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但 無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行， PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：(1) 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備。(2) 擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和 PCR 擴(kuò)增。(3) 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。(4) 各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備一 PCR擴(kuò)增一產(chǎn)物分析一產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。2. 分裝試劑： PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或

6、負(fù)壓工 作臺配制和分裝。 所有的加樣器和吸頭需固定放于其中， 不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA 和其他來源的 DNA：(1) PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。(2) 引物和 dNTP 用高壓的雙蒸水在無 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制。(3) 引物和 dNTP 應(yīng)分裝儲存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因3. 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因， 樣品間的交叉污染也是原因之一。 因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真， 在 樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：(1) 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。(2) 使用一次性吸頭， 嚴(yán)禁與 PCR 產(chǎn)物分析室

7、的吸頭混用， 吸頭不要長時(shí)間暴露 于空氣中，避免氣溶膠的污染。(3) 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于 管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。(4) 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將 dNTP 、緩沖液、引物和酶混合好， 然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。(5) 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。(6) 操作時(shí)設(shè)立陰陽性對照和空白對照， 即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié) 助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。(7) 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或 標(biāo)本 DNA 的污染，最好

8、使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加 樣器，至少 PCR 操作過程中加樣器應(yīng)該專用， 不能交叉使用， 尤其是 PCR 產(chǎn)物 分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。(8) 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論、追蹤污染源 如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染 1. 設(shè)立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時(shí)， 應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品， 因強(qiáng)陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列， 反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照， 100 個(gè)拷貝 之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對照的選擇亦要慎重，因?yàn)?PCR 敏感 性極高，可以從其

9、它方法( Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等)檢測陰性的標(biāo)本中檢 測出極微量的靶分子。 此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括 PCR 體系中各試劑的時(shí)機(jī)對照， 即包括 PCR 反應(yīng)所需的全部成分， 而不加模板 DNA, 這對監(jiān)測試劑中 PCR 產(chǎn)物 殘留污染是非常有益的。 如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果， 就是某一種或數(shù) 種試劑被污染了。 此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的 反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。2.環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外， 更換試劑后， 若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污 染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密， 則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的

10、污染 源主要有：(1) 模板提取時(shí)真空抽干裝置。(2) 凝膠電泳加樣器。(3) 電泳裝置。(4) 紫外分析儀。(5) 切膠用刀或手術(shù)刀片。(6) 離心機(jī)。(7) 冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺面等。此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑 污染源： (a) 用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源。 (b)0.1ml 去離子水浸泡。 (c) 取 5ml 做 PCR 實(shí)驗(yàn)。 (d) 電泳檢測結(jié)果。(8) 氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)， 仍不能查找到確切污染源， 則污染可能是由空氣中 PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的， 此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場所， 若條件不允許， 則重新設(shè)計(jì)新 的引物(與原引物無相關(guān)性)。三、污染處理

11、1. 環(huán)境污染(1) 稀酸處理法：對可疑器具用 1mol/L 鹽酸擦拭或浸泡，使殘余 DNA 脫嘌呤。(2) 紫外照射( UV )法：紫外波長( nm )一般選擇 254/300nm, 照射 30min 即可。需要注意的是，選擇 UV 作為消除殘留 PCR 產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮 PCR 產(chǎn) 物的長度與產(chǎn)物序列中堿基的分布， UV 照射僅對 500bp 以上長片段有效，對 短片段效果不大。 UV 照射時(shí)， PCR 產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體，這些二聚體 可使延伸終止，但并不是 DNA 鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且 UV 照射還可 使二聚體斷裂。 形成二聚體的程度取決于 UV 波長，嘧啶二聚體的類

12、型及與二聚 體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列。在受照射的長 DNA 鏈上，形成二聚體缺陷的數(shù)量少 于 0.065/ 堿基，其他非二聚體的光照損傷(如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體，胸腺嘧啶 乙二醇，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等)均可終止Taq DNA聚合酶的 延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng)。 如果這些位點(diǎn) (0.13/ 堿基)在 DNA 分子上隨機(jī)分布，一個(gè) 500bp 片段的 DNA 分子鏈上將有 32 處損傷位點(diǎn)，那 么，105 個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷。相反，如果 100bp 的 片段，每條鏈上僅有 6 處損傷， 105 個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒有任何損傷。 這就是 UV 照射

13、有一定的片段長度限制的原因。2. 反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理：(1) DNase I 法：PCR混合液(未加模板和 Taq聚合酶)加入0.5U DNase I, 室溫反應(yīng) 30 min 后加熱滅活，然后加入模板和 Taq 聚合酶進(jìn)行正常 PCR 擴(kuò)增 該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染 DNA 的序列。(2) 內(nèi)切酶法：選擇識別 4 個(gè)堿基的內(nèi)切酶(如 Msp I 和 Taq I 等)，可同時(shí)選 擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷， 室溫作用 1h 后加熱滅活進(jìn) 行 PCR。(3) 紫外照射法：未加模板和 Taq 聚合酶的 PCR 混合液進(jìn)行紫外照射，注意事 項(xiàng)與方法同上述 UV 照

14、射法。(4) g 射線輻射法： 1.5kGy 的輻射可完全破壞 0.1ng 基因組 DNA,2.0 kGy 可 破壞 104 拷貝的質(zhì)粒分子， 4.0 kGy 仍不影響 PCR, 但高于此限度會(huì)使 PCR 擴(kuò) 增效率下降。引物可受照射而不影響 PCR,g 射線是通過水的離子化產(chǎn)生自由基 來破壞 DNA 的。3. 尿嘧啶糖苷酶( UNG )法 由于 UV 照射的去污染作用對 500bp 以下的片段效果不好，而臨床用于檢測的PCR 擴(kuò)增片段通常為 300bp 左右，因此 UNG 的預(yù)防作用日益受到重視和肯定 (1) 原理：在 PCR 產(chǎn)物或引物中用 dU 代替 dT. 這種 dU 化的 PCR 產(chǎn)

15、物與 UNG 一起孵育，因 UDG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的 N- 糖基鍵，可除去 dU 而阻止 TaqDNA 聚合酶的延伸， 從而失去被再擴(kuò)增的能力。 UNG 對不含 dU 的 模板無任何影響。 UNG 可從單或雙鏈 DNA 中消除尿嘧啶，而對 RNA 中的尿嘧 啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。(2) dUTP 法：用 dUTP 代替 dTTP, 使產(chǎn)物中摻入大量 dU. 在再次進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 前，用 UNG 處理 PCR 混合液即可消除 PCR 產(chǎn)物的殘留污染。由于 UNG 在 PCR 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì)影響含 dU 的新的 PCR 產(chǎn)物。(3) dU引物法：

16、合成引物時(shí)以dU代dT,這樣PCR產(chǎn)物中僅5 /端帶dU.UNG 處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增。對長片段( 1-2kb 以上)的擴(kuò)增用 dUTP 法效率較用 dTTP 低，而用 dU 法就可克服這一缺點(diǎn)。 dU 引物最好將 dU 設(shè)計(jì)在3/端或近/端。該法僅能用于引物以外試劑的處理。(4) 優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來源的污染； UNG 處理可以和 PCR 擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng) 管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量 dU 存在，可徹底消除污染源。(5) 需注意的是摻入 dUTP 的 DNA 不應(yīng)對產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物克隆時(shí)，應(yīng)該轉(zhuǎn)化 UNG- ( UNG 缺陷)大腸桿菌受體菌，否則

17、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì) 被受體菌 UNG 消化掉。4. 固相捕獲法用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì)，原理如下：(1 )用一生物素標(biāo)記的單鏈 RNA 探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū)。(2 )用包被鏈霉親和素的固相載體來捕獲帶有生物素探針的雜交核酸， 通過漂洗 可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)(3 )洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非 RNA探針雜交區(qū)域。第(2)步的漂洗后可 用 PCR 檢測以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染。5. RS-PCR 法( RNA-specific PCR )也稱為鏈特異性PCR,主要指用于RNA模板的特異性PCR法，該法可明顯降低 假陽性而不影響PCR的敏感性。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的 3 /端(A 區(qū))有2 0個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列，5 /端2 0個(gè)核苷酸(C區(qū)) 為附加修飾堿基。與 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA 與多余引物