HPLC_UV法定量測定發(fā)酵液中的S_腺苷_L_甲硫氨酸_蔡恒

1、中國生物工程雜志 China Biotechnology ,2007,27(11:7376HPLC-UV 法定量測定發(fā)酵液中的S-腺苷-L-甲硫氨酸蔡 恒 鄭偉剛 萬紅貴*郭一丹 王 濤(南京工業(yè)大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院 南京 210009摘要 采用高效液相色譜-紫外檢測器(H PL C-UV 定量測定發(fā)酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸(S A M 的含量。結(jié)果表明,S-腺苷-L-甲硫氨酸濃度在0.11.0g /L 時(shí),其峰面積(Y與相應(yīng)的濃度(X 呈線性關(guān)系,線性方程為Y=13.937X -0.1949,相關(guān)系數(shù)為0.9969。S-腺苷-L-甲硫氨酸的平均回收率為99.89%101.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)

2、偏差為0.48%1.36%。該方法精密度、準(zhǔn)確度好,穩(wěn)定性高,能簡便、快速、準(zhǔn)確地測定發(fā)酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量。關(guān)鍵詞 S-腺苷-L-甲硫氨酸 HPL C U V 中圖分類號(hào) Q815收稿日期:2007-05-29 修回日期:2007-09-24*通訊作者,電子信箱:l ub i nne wto m .co mS-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl -L-methi onine是人體內(nèi)的重要中間活性物質(zhì),具有轉(zhuǎn)甲基,轉(zhuǎn)氨丙基和轉(zhuǎn)硫基作用。主要用于治療肝炎、抑郁癥和關(guān)節(jié)炎,有增強(qiáng)身體免疫力的功能,是一種重要的藥物中間體,需求量很大,市場很廣13。S-腺苷-L-甲硫氨酸主要通過發(fā)

3、酵法生產(chǎn),目前介紹S-腺苷-L-甲硫氨酸測定方法的文獻(xiàn)不是分離效果不理想,就是流動(dòng)相價(jià)格昂貴。本文嘗試采用一種新的流動(dòng)相,建立S-腺苷-L-甲硫氨酸的HPLC-UV 定量分析方法,為發(fā)酵液中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量測定提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確的方法。1 材料與方法1.1 儀 器高效液相色譜儀(A lltech,包括426HPLC 泵,UV 2000檢測器等;TGL-16G 冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠;BS124S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司,L G 冰箱。1.2 試 劑乙腈(色譜純,Caledon Labor atories 公司,S-腺苷-L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sig ma

4、 公司,三氟乙酸(AR ,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,七氟丁酸(AR ,F l uka 公司,所用水由M illi-Q 純水機(jī)制備。1.3 色譜條件色譜柱:Prevail C 18(250mm 4.6mm ,5L m 流動(dòng)相:0.14%三氟乙酸(含0.06%七氟丁酸溶液-乙腈溶液(80B 20 流速:0.8m l /m in 檢測器:UV A lltech 波長:254n m 進(jìn)樣量:20L l 溫度:25e 1.4 樣品溶液的配制S-腺苷-L-甲硫氨酸發(fā)酵液經(jīng)4000r /m in 的速率離心10m in 后,取菌體用等體積20%的高氯酸萃取1.5h ,在4000r /m in 的速率離心10

5、m in ,取上清液經(jīng)0.22L m 水膜過濾后待用。1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制S-腺苷-L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品25mg 全部用超純水溶解,振蕩并定容至10m ,l 得到濃度為2.5g /L 的S-腺苷-L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。然后分別制得質(zhì)量濃度為0.1g /L 、0.4g /L 、0.5g /L 、0.8g /L 、1.0g /L ,所用水均為超純水。2 結(jié)果與討論2.1 色譜條件的選擇S-腺苷-L-甲硫氨酸分子中有共軛雙鍵,有紫外吸收,可以直接使用紫外檢測器檢測。根據(jù)S-腺苷-L-甲硫氨酸分子結(jié)構(gòu),查有關(guān)資料,它的最大吸收波長為254n m 。關(guān)于S A M 的檢測方法都是HPLC-UV,但是

6、流動(dòng)相和柱子的選用有所不同。揚(yáng)州大學(xué)蔡瑞4是以甲酸銨(甲酸調(diào)pH 值到4.0為流動(dòng)相,陽離子色譜柱,但是檢測時(shí)間太長,并且分離度不好;浙江工業(yè)大學(xué)陳小龍5以甲酸銨(甲酸調(diào)pH 值到3.0為流動(dòng)相,反相C-18拄,但是同樣存在檢測時(shí)間太長的問題;浙江大學(xué)趙曉星6是以40mmol /L 磷酸二氫銨2mmol /L 庚烷磺酸鈉18%(V /V 甲醇水溶液當(dāng)流動(dòng)相,C-18色譜柱,檢測方法好,但是流動(dòng)相原料庚烷磺酸鈉價(jià)格昂貴,不易采用。本實(shí)驗(yàn)起始用甲醇/水當(dāng)流動(dòng)相,有機(jī)相的比例從100%開始,每次遞減20%,但是效果也不理想。以已腈/水當(dāng)流動(dòng)相,體積比為100B 0、90B 10、80B 20、70B

7、 30的0.14%三氟乙酸(含0.06%七氟丁酸溶液-乙腈溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)采用不同的流速,分別為0.8m l /m in ,1.0m l /m in ,1.2m l /m i n ,1.6m l /m i n 進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,體積比為80B 20時(shí),流速為0.8m l /m i n 時(shí)S-腺苷-L-甲硫氨酸色譜峰與雜質(zhì)峰完全分離,色譜峰保留時(shí)間短,峰形良好,故選用該流動(dòng)相。溫度對(duì)樣品的分解影響比較大,同時(shí)考慮到柱子的性能,采用25e 為檢測溫度較佳。2.2 線性范圍及檢出限在1.3節(jié)規(guī)定的色譜條件下,對(duì)5種不同濃度的S-腺苷-L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,以S-腺苷-L-甲硫氨酸標(biāo)

8、準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積/106為縱坐標(biāo),以最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=13.937X +0.1949,相關(guān)系數(shù)r =0.9969,線性范圍為0.11.0g /L。 圖1 S-腺苷-L-甲硫氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線F ig .1 C a li b ra ti on cu rve of S-Ad enosyl-L -m e th i on i ne2.3 精密度和重復(fù)性對(duì)0.4g /L 的S-腺苷-L-甲硫氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)6次平行測定,測定結(jié)果如表1所示。S-腺苷-L-甲硫氨酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.32%,表明該方法精密度良好。對(duì)同一發(fā)酵液樣品溶液經(jīng)6次平行測

9、定,測定結(jié)果如表2所示。S-腺苷-L-甲硫氨酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.69%,表明該方法重復(fù)性良好。表1 S-腺苷-L-甲硫氨酸的精密度測定結(jié)果T ab le 1 P rec isi on of S-Ad enosyl -L-m e th i on ine測定值/(g /L平均值/(g /L標(biāo)準(zhǔn)偏差RS D %表2 S-腺苷-L-甲硫氨酸的重復(fù)性測定結(jié)果T ab le 2 R epr oduc i b ility of S-Ad enosyl-L -m e th i on ine測定值/(g /L平均值/(g /L標(biāo)準(zhǔn)偏差RS D %2.4 穩(wěn)定性色譜系統(tǒng)穩(wěn)定后,對(duì)同一發(fā)酵液樣品溶液分別在0h

10、、2h 、4h 、6h 、8h 、10h 、12h 時(shí)進(jìn)樣,測定結(jié)果如表3所示。S-腺苷-L-甲硫氨酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%,表明該方法在12h 以內(nèi)穩(wěn)定性良好。表3 S-腺苷-L-甲硫氨酸的穩(wěn)定性測定結(jié)果Tab le 3 S tab ility of S-Aden osy l -L-m eth ion i ne測定值/(g /L平均值/(g /L標(biāo)準(zhǔn)偏差1.62.5 回收率將一定含量的S-腺苷-L-甲硫氨酸發(fā)酵液樣品溶液分成3組,每組3份。每組分別加入低、中、高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.3節(jié)規(guī)定的色譜條件下進(jìn)樣。樣品的平均回收率為99.89%101.7%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.48%1.3

11、6%(表4,表明該方法準(zhǔn)確可靠。表4 S-腺苷-L-甲硫氨酸的回收率測定結(jié)果T ab le 4 R ecover i es of S-Adenosyl -L-m e th i on i n e組號(hào)添加量/L g 測得量/L g 回收率%/平均回收率%/RS D %/11.360.280.285101.80.280.770.821100.12.6 樣品的測定分別將S-腺苷-L-甲硫氨酸發(fā)酵液樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)742007,27(11蔡 恒等:H PL C-UV 法定量測定發(fā)酵液中的S-腺苷-L-甲硫氨酸溶液進(jìn)樣測定,標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的色譜圖如圖2所示。由圖可知,樣品溶液中S-腺苷-L-甲硫氨酸色譜

12、峰與雜質(zhì)峰完全分離,標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中S-腺苷-L-甲硫氨酸的保留時(shí)間分別為12.721m in 、12.503m in ,保留時(shí)間短,可達(dá)到快速檢測的目的。根據(jù)S-腺苷-L-甲硫氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,按外標(biāo)法計(jì)算可得樣品中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量。 圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和發(fā)酵液樣品的色譜圖F i g .2 C hr o m a togr am s of t h e standa rd(aand the s am p le(b 3 結(jié) 論本文通過HPLC-UV 色譜條件的選擇,建立了使用HPLC-UV 定量測定發(fā)酵液中的S-腺苷-L-甲硫氨酸的方法。結(jié)果表明,最佳HPL C-UV 色譜條件如下,

13、流動(dòng)相為體積比80B 20的0.14%三氟乙酸(含0.06%七氟丁酸溶液-乙腈溶液,流速為0.8m l /m i n ,紫外檢測器的波長為254nm 。該方法操作簡單快速,穩(wěn)定性高,精密度、準(zhǔn)確度好,可滿足發(fā)酵液中的S-腺苷-L-甲硫氨酸定量分析要求。該方法也可用于S-腺苷-L-甲硫氨酸分離純化過程中S-腺苷-L-甲硫氨酸的含量測定,為發(fā)酵法生產(chǎn)S-腺苷-L-甲硫氨酸的整個(gè)工藝過程提供了可靠的檢測手段。參考文獻(xiàn)1李東陽,于健,田露,等.利用重組P ic h i a pa st ori s 生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸.生物工程學(xué)報(bào),2002,18(3:295299LiD Y ,Yu J ,Tian L ,

14、et a.l Ch i nes e Jou rnal of Biot echnol ogy ,2002,18(3:2952992申麗,余志良,姜涌明,等.重組P ic h i a pa st oris 的發(fā)酵條件初步研究.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2004,35(2:7378Shen L ,Yu Z H L ,Ji ang Y M,et a.l Ch i nese J ou rnal of Phar m aceu ticals ,2004,35(2:73783劉慧,吳堅(jiān)平,林建平.S-腺苷-L-甲硫氨酸的分離純化及其穩(wěn)定產(chǎn)品的制備.中國生化藥學(xué)雜志,2002,23(6:284287Li u H,W u

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17、 adenosyl O L O m et h i on i ne and P reparation Process of Its Stab l e Salts .H ang Zhou :Zhejiang Un i versit y College of M aterials Sccienceand Che m icalE ng i neeri ng ,20067576C A I H eng Z H E NG Wei-gang WAN H ong-gui GUO Y i-dan WA NG Tao(College of Phar m acy and Life Science,Nan ji ng

18、Univers it y of Technol ogy,N an ji ng210009,Ch ina Ab str act A method f or the deter m i n ation of S-Adenosyl-L-me t h ionine in f e r m en tation liquid usi n g the high perf or m ance liqu i d chr o matography coupled with U V detector(HPL C-U Vwas deve loped.A good linearity was obtained i n t

19、he range of0.11.0g/L(r=0.9969f or S-Adenosyl-L-methionine.The average recove ries of S-Adenosyl-L-methionine wer e99.89%101.7%and t h e relative standar d deviati o ns we r e0.48%1.36%.The method is si m ple and rapid w ith reproduci b ility f or the de t e r m ina tion of S-Adenosyl-L-methionine i n f er m ent liquid.K ey w ord s S-Adenosyl-L-methionine H PL C UV科學(xué)出版社精品圖書基因IX(原版書Ben ja m in Lewin著幾十年來,Ben j a m i n Lewin的經(jīng)典著作5基因6系列在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方面為教育界提供了最前沿的研究內(nèi)容,包括基因結(jié)構(gòu)、測序、組織和表達(dá)。5基因IX6在內(nèi)容上作了徹底的更新,包括新增的/表觀遺傳學(xué)效應(yīng)0一章,是業(yè)已出版的最前沿、最全面和最適合學(xué)生閱讀的分子生物學(xué)著作。比較基因組學(xué)M.克拉克主編本書講述了各種模式生物基因組在人類基因組