草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗生產(chǎn)工藝的比較

1、Comparison of the Selective Culture Mediums of Aeromonas Hydrophila LING Ho ng li, LU Chengping *, CHEN Huaiqing , M A Xiang dongCollege of Veterinary M ed icine , Nanjing Agriculture U nivers ity , Nanjing 210095Abstract Each of the 121Aeromonas hy dr o p hila strains w ere cultured o n each of the

2、 three selective m edium s , AHM (Aeromonas hyd rop hila M edium , A PM (Aer omonas Py razinam idase A ctivity M edium and RS(Rimler-Sho tts Medium . T he rate of detection by the three mediums w as 54. 76%, 81. 33%and 83. 54%respectiv ely. T he strains w hose ox idase w ere positiv e in AHM or RS m

3、ay be prelim inary ly identified as Ah . AHM and RS w er e recom mended for identification of Ah str ains fr om clinic samples.key words Aeromonas hy dr o p hila , Selective cultures, Com parison*C orres ponding auth or草魚出血病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗生產(chǎn)工藝的比較葉雪平楊廣智羅毅志曹錚浙江省淡水水產(chǎn)研究所 , 湖州 313001收稿日期 :1998-03-02摘 要 比較 了方瓶 靜

4、置 培養(yǎng)、 10×200ml 轉(zhuǎn) 管培 養(yǎng)和 細(xì)胞生物反 應(yīng)器微載 體培養(yǎng) 3種 方法增 殖細(xì)胞 和病 毒的效率 , 以細(xì)胞 生物反 應(yīng)器微 載體培 養(yǎng)法的 效率最高 , 與靜置培養(yǎng)法相比較 , 單位 培養(yǎng)液細(xì)胞增 殖量提高 2025倍 , 病毒增殖 量 T CID 50測 定增加 1. 65對數(shù) 值 , LD 50測 定增 加 1. 45對 數(shù) 值。 經(jīng)濟 效 益比 較 , 疫苗制備的培養(yǎng)液成本 , 以細(xì)胞生 物反應(yīng)器微載 體培 養(yǎng)法最低。 已研究 出以細(xì) 胞生物 反應(yīng)器 微載體 培養(yǎng)法增殖細(xì)胞和病毒為基本生產(chǎn)工 藝的工廠化生 產(chǎn)草魚出血病細(xì)胞疫苗工藝流程。關(guān)鍵詞 草魚出血病 ;

5、細(xì)胞疫苗 ; 生產(chǎn)工藝草魚出血病是我國淡水漁業(yè)中危害嚴(yán)重 的病毒性魚病 , 我國從 70年代開始 , 相繼研究 成功草魚出血病組織疫苗和細(xì)胞疫苗免疫防 治草魚出血病 , 在生產(chǎn)上收到了較好的效果 , 全國各地普遍推廣應(yīng)用。 我們在建立敏感細(xì) 胞株和篩選出免疫原性強的毒株以及實驗室 胞疫苗工廠化生產(chǎn)工藝的研究。 通過對幾種 生產(chǎn)工藝的比較研究 , 認(rèn)為細(xì)胞生物反應(yīng)器 微載體懸浮培養(yǎng)增殖細(xì)胞和病毒作為疫苗生 產(chǎn)工藝具有明顯優(yōu)勢。 現(xiàn)將研究方法和結(jié)果 報道如下。1材料和方法1. 1細(xì)胞和病毒 采用本所建立的草魚吻 端組織細(xì)胞株 ZC-7901和草魚胚胎細(xì)胞 CP-80(細(xì)胞株由本所建株并保存 。 草

6、魚出血病 病毒株為本所篩選的 ZV -8909(由本所鑒定 和保管 。 以適應(yīng)培養(yǎng)法培養(yǎng)和增殖病毒 1。 1. 2培養(yǎng)液和維持液 細(xì)胞生長的培養(yǎng)液 為 添 加 10%小 牛 血 清 的 199培 養(yǎng) 液 , 內(nèi) 含 100IU /m l 青霉素和 100L g /ml 鏈霉素 , pH 7. 47. 6。 微載體 懸浮培養(yǎng)液 的維持液 為含 2%5%小牛血清的培養(yǎng)液 , 其余同靜置培 養(yǎng)的維持液。 91998, 32(4 :912/葉雪平等中國獸藥雜志瓶 , 按常規(guī)法靜置培養(yǎng) (以下稱方瓶法 。 1. 4 轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 采用 200ml 玻璃 圓瓶 , 在 AD-1型單細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)機上培養(yǎng) (以下

7、稱 轉(zhuǎn)管法 2。1. 5細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng) 采 用 NBS 細(xì)胞生物反應(yīng)器 , 以 GT -2微載體為 載體 (以下稱反應(yīng)器法 , 濃度為 45m g/m l, 細(xì)胞接入濃度為 3050萬 /m l 。 細(xì)胞吸附 6h 后開始攪拌 , 攪拌速度為 40r /min , 空氣飽和 度為 40%, 細(xì)胞培養(yǎng)液的 pH 為 6. 87. 0。 細(xì) 胞在微載體上長滿單層后 , 以吸附法接入病 毒 , 維持液的 pH 為 7. 47. 6, 第 46d 收獲 病毒。 具體方法按文獻 3進行。1. 6疫苗的制備和效價測定 按文獻 4所 述方法進行。2結(jié)果2. 1細(xì)胞增殖方法的效率比較 在細(xì)胞和

8、培養(yǎng)液相同的條件下 , 我們比較了方瓶靜置 培養(yǎng)、 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)和細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體 懸浮培養(yǎng)增殖細(xì)胞的效率 , 結(jié)果詳見表 1。表 1幾種細(xì)胞增殖方法的效率比較培養(yǎng) 方法 細(xì)胞生長面積(m 2培養(yǎng)液量 (L(m 2/L 細(xì)胞總產(chǎn)量(107個 產(chǎn) 量(107個 /L 較靜置 培養(yǎng)提 高倍數(shù)方瓶法 0. 02860. 30. 09512154050轉(zhuǎn)管法 0. 220. 30. 7335060167200反應(yīng)器法 2. 81. 22. 496012008001000從表 1可知反應(yīng)器法增殖細(xì)胞 , 具有細(xì)胞 生長面積大、 消耗的培養(yǎng)液少、 單位培養(yǎng)液細(xì) 胞產(chǎn)量高的特點 , 較方瓶法提高細(xì)胞產(chǎn)量

9、20 25倍。 因此細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體懸浮培 養(yǎng)法增殖細(xì)胞是一種高效低耗的方法。 2. 2病毒增殖方法的比較 以這 3種方法增 殖細(xì)胞后 , 將 ZV-8909毒株的病毒液接入細(xì) 胞 , 經(jīng) 病 毒 增 殖 后 , 收 獲 病 毒 培 養(yǎng) 液 , 以 TCID 50和 LD 50法測定接入前和病 毒增殖后 的毒力 , 測定結(jié)果列于表 2(以對數(shù)值表示 。表 2幾種病毒增殖方法的 效率比較培養(yǎng)方法病毒滴度 (以對數(shù)值表示 接入 收獲 增殖量 T CID 50LD 50T CID 50LD 50TC ID 50LD 50方瓶法 3. 13. 05. 75. 32. 62. 3轉(zhuǎn)管法 3. 13.

10、 06. 55. 83. 42. 8反應(yīng)器法 3. 753. 08. 06. 754. 253. 75從表 2可知 , 上述幾種培養(yǎng)方法增 殖病 毒 , 以反應(yīng)器最高 , 與方瓶法相比較 , 病毒滴 度以 TCID 50法測定可增加 1. 65對數(shù)值 , LD 50法測定可增加 1. 45對數(shù)值。2. 3幾種疫苗生產(chǎn)工藝的經(jīng)濟效益比較 以上幾種培養(yǎng)方法增殖細(xì)胞和病毒后 , 在相 同條件下制備免疫保護率 80%以上的細(xì)胞疫 苗 , 以生產(chǎn)周期、 一次生產(chǎn)量、 所需培養(yǎng)液成 本 (199培養(yǎng)基、 小牛血清、 抗生素、 微載體等 以及操作條件 (包括加液、 進樣、 pH 調(diào)節(jié)等 等指標(biāo)進行分析比較

11、, 結(jié)果詳見表 3。表 3幾種疫苗制備工藝的經(jīng) 濟效益比較 制備工藝生產(chǎn)周期(天 一次生產(chǎn)量(L生產(chǎn) 1L 疫苗所需培養(yǎng)液成本(元 操作 控制 條件 方瓶法 14180. 376. 00人工 轉(zhuǎn)管法 141811. 516. 4823. 92人工 反應(yīng)器法 141824309. 2611. 18自動 從表 3可知 , 細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng) 法制備疫苗 , 具有一次生產(chǎn)量大、 單位產(chǎn)量成 本低、 能自動控制、 所化人力較少等優(yōu)點。 本 次實驗只使用 1. 5L 的細(xì)胞生物反應(yīng)器 , 若使 用 5L 或以上的細(xì)胞反應(yīng)器 , 其一次性產(chǎn)量可 更高。 因此以細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)法 為基本生產(chǎn)工

12、藝制備細(xì)胞疫苗 , 完全符合工 廠化生產(chǎn)的要求。2. 4細(xì)胞疫苗工廠化生產(chǎn)工藝流程 在實 驗室制備細(xì)胞疫苗研究的基礎(chǔ)上 , 應(yīng)用細(xì)胞 生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)法增殖細(xì)胞和病毒為 基本生產(chǎn)工藝制備細(xì)胞疫苗的工廠化生產(chǎn)工 藝流程 , 以下圖 1表示。10 中國獸藥雜志 1998, 32(4 :912/葉 雪平等 ZC -7901或 C P-80細(xì)胞病毒株 ZV-8909 細(xì)胞瓶靜止傳代培養(yǎng)在 ZC -7901或 CP -80細(xì)胞中吸附培養(yǎng)旋轉(zhuǎn)管擴大培養(yǎng)細(xì)胞在 ZC-790或 CP-80 細(xì)胞中適應(yīng)培養(yǎng) 細(xì)胞生物反應(yīng)器增殖細(xì)胞旋轉(zhuǎn)管擴大培養(yǎng)病毒 細(xì)胞生物反應(yīng)器增殖病毒 收獲病毒、 測定毒力收獲病毒并測定

13、毒力 福爾馬林滅活 ; 加佐劑和增效劑檢驗 (無菌性、 安全性、 保護率測定 分裝 4保存圖 1細(xì)胞疫苗工廠化生產(chǎn)工藝流程圖3討論細(xì)胞疫苗制備工藝主要有方瓶靜置培養(yǎng) 法、 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、 多表面繁殖器、 塑料螺旋 管轉(zhuǎn)瓶法、 毛細(xì)管繁殖器、 懸浮培養(yǎng)法以及細(xì) 胞生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)法。 其中細(xì)胞生物 反應(yīng)器微載體培養(yǎng)法是近期發(fā)展起來的先進 技術(shù)。 由于該技術(shù)具有細(xì)胞生長面積大、 速度快、 物質(zhì)消耗低、 污染機會少 , 同時還具有容量大、 自動化程度高的特點 , 從而能滿足工廠 化生產(chǎn)的要求。通過 3種生產(chǎn)草魚出血病細(xì)胞疫苗的方 法比較 , 結(jié)果顯示 , 細(xì)胞生物反應(yīng)器微載體培 養(yǎng)法不僅產(chǎn)量高

14、, 而且成本低 , 表現(xiàn)出其在草 魚出血病細(xì)胞疫苗生產(chǎn)中的優(yōu)越性。 有資料 表明 , 在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)方面 , 國外應(yīng)用細(xì)胞生 物反應(yīng)器增殖動物細(xì)胞進行了較多的研究 , 并已用于各類疫苗、 干擾素、 單克隆抗體等生 物制品的工廠化生產(chǎn)。 國內(nèi)這方面的研究和 應(yīng)用也有了較快的發(fā)展 , 但尚無用于魚類細(xì) 胞培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)的報道。 目前 , 我國已有國 產(chǎn)的生物反應(yīng)器和微載體 , 因此應(yīng)用細(xì)胞生 物反應(yīng)器工廠化生產(chǎn)草魚出血病細(xì)胞疫苗有 著良好的發(fā)展前景。 參考文獻1 張念慈 , 楊廣智 . 草 魚出血病 病毒在 ZC-7901細(xì)胞株中適應(yīng)培養(yǎng)及 其病毒培養(yǎng)物的 某些生物 特性 . 魚病簡 訊 , 19

15、86(22 曹錚 , 沈 錦玉 , 羅 毅志 等 . 魚類 細(xì)胞 的旋轉(zhuǎn) 管培 養(yǎng)法 .魚病簡訊 , 1988(13葉 雪平 , 楊廣智 , 羅毅 志等 . 細(xì)胞生 物反應(yīng)器大 規(guī)模培養(yǎng)草魚細(xì)胞和病毒 . 水產(chǎn)學(xué)報 . 1992, 第 16卷第 1期 4楊 廣智 , 張念慈 , 葉雪 平等 . 草魚出 血病細(xì)胞疫 苗制備技術(shù)研究 . 魚病簡訊 , 1990(1Studies on Technology of Grass C arp HaemorrhageInactive Vaccine ProductionYE Xueping , YANG Guangzhi, LUO Yizhi, CHA O

16、 zhenZhejiang Institute of Fresh water Fish eries, Huzhou 313001Abstract Studies had been conducted on co mpar ing the efficiency of cell and virus multiplicaion by thr ee culture m ethods, statio nary culture in normal culture flasks, r otating culture in 200m l columned culture flasks and micr oca

17、rrier suspensio n cultur e in bio -reacto r. Results show ed that the last m ethod w as most efficient . Its cell multiplication per unit liquid culture media w as 20to 25times, virus repro duction assessed by TCID 501. 65co mmon log arithm values and by LD 501. 45commo n log arithm values more than

18、 those of the first , 11 1998, 32(4 :912/葉雪平等中國獸藥雜志metho d w as the least. The w ork pro ccess for Grass carp haemo rrhage cell vaccine production in a big scale w as developed based o n the principle production technolo gy of micr ocarrier suspention culture in bio-reacter to multiplicate cells and

19、 reproduct viruses.Key words Grass carp haemorr hag e, Cell vaccine, Pr oduction technolog y鹽酸林可霉素 -鹽酸環(huán)丙沙星復(fù)方制劑含量測定方法研究吳佩玲 歐陽林山中國獸藥監(jiān)察所 , 北京 100081收稿日期 :1998-05-04摘要 用高效液相色譜法及紫外分 光光度法分別測 定鹽 酸林 可霉 素、 鹽酸 環(huán)丙 沙星 的含 量 , 結(jié) 果表明 , 線性關(guān) 系良好 , 回收 率滿意 , 適用 于該產(chǎn) 品的含量測定 。關(guān)鍵 詞 鹽酸林 可霉素 ; 鹽酸環(huán)丙 沙星 ; 高效液相色譜 ; 紫外分光光度法鹽酸林可霉素為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 , 主要對革蘭氏陽性菌有效 ; 鹽酸環(huán)丙沙星為氟代喹諾酮藥物 , 對革蘭氏陰性菌療效較好。 該復(fù)方制劑經(jīng)臨床試驗證明 , 對金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的抗菌力及抗菌譜均優(yōu)于單方制劑。該制劑中兩種原料的含量測定方法已收載于 中國 獸藥典 1和 獸藥 質(zhì)量標(biāo) 準(zhǔn) 2中 , 而復(fù)方制劑的含量測定方法迄今未見報道