提取血液DNA標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、江陰力通生命科學(xué)技術(shù)有限公司 S0P文件題目提取血液DNA標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編碼頁 數(shù)3 /31 目的：規(guī)范提取DNA的操作流程。2 范圍：適用于從抗凝血中提取DNA。3 職責(zé)：操作人員嚴(yán)格按照本操作規(guī)程進(jìn)行血液DNA的提取。4 內(nèi)容4.1 原理：紅細(xì)胞裂解緩沖液（RCLB）可裂解紅細(xì)胞，離心后紅細(xì)胞碎片與白細(xì)胞分離。SDS是離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白質(zhì)，從而破壞細(xì)胞膜，使白細(xì)胞破碎。核裂解液（NLB）可裂解白細(xì)胞核，釋放染色體，經(jīng)過NaCl、氯仿抽提，可使蛋白質(zhì)及脂類物質(zhì)與DNA分離，再經(jīng)過乙醇純化，使一些離子等雜質(zhì)與DNA分離，并促使DNA脫水析出，從而得到較純的DNA。4

2、.2 準(zhǔn)備工作儀器：久保田離心機(jī)、渦旋振蕩器、移液器、數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱、5冰箱試劑：紅細(xì)胞裂解緩沖液（RCLB）、NLB和SDS的混合緩沖液、6mol/L NaCl、氯仿、95冷凍乙醇、75乙醇、TE緩沖液4.3 操作流程4.3.1 裂解及洗滌紅細(xì)胞：4.3.1.1 將冷凍的血樣室溫溶化，用渦旋振蕩器震蕩后短暫離心并分裝到2.5ml冷凍管中，每個(gè)冷凍管300450µl。將冷凍管依次編號。4.3.1.2 每管加入紅細(xì)胞裂解緩沖液（RCLB）2000µl，顛倒數(shù)次后放置5分鐘。4.3.1.3 將上述冷凍管對稱裝入離心機(jī)，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘。4.3.1.4 取出冷凍

3、管，用移液器小心吸去管中上層液體，再加入紅細(xì)胞裂解緩沖液（RCLB）600µl，用渦旋振蕩器將沉淀振蕩混勻，使用離心機(jī)以10000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心2分鐘。4.3.1.5 取出冷凍管，用移液器小心吸去管中上層液體，再加入紅細(xì)胞裂解緩沖液（RCLB）600µl，用渦旋振蕩器將沉淀振蕩混勻，使用離心機(jī)以3300轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心4分鐘，棄去上層液體。4.3.2 核裂解4.3.2.1 用移液器吸取NLB和SDS的混合緩沖液270µl加入冷凍管中。4.3.2.2 再用移液器吸取NLB和SDS的混合緩沖液270µl，利用移液器吸嘴將冷凍管中沉淀刮散，再將緩沖液注入

4、。4.3.2.3 將冷凍管置于數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱中56水浴，根據(jù)沉淀團(tuán)塊大小水浴0.51小時(shí)。4.3.3 除雜質(zhì)4.3.3.1 取出冷凍管，加入6mol/L的NaCl溶液180µl，用渦旋振蕩器充分振蕩混勻。4.3.3.2 加入氯仿270µl，顛倒混勻，手拿冷凍管上下劇烈震蕩。4.3.3.3 將冷凍管對稱裝入離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘。4.3.3.4 取出冷凍管，用移液器吸取第一層清液，裝入另外空的冷凍管中，編上相同的編號，同時(shí)估量移取清液的體積。4.3.4 純化DNA4.3.4.1 加入2倍體積的95%的冷凍乙醇，緩慢顛倒數(shù)次至DNA析出，將冷凍管對稱裝入離

5、心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘。取出冷凍管，用移液器吸去上清液，保留沉淀。4.3.4.2 加入與步驟4.3.4.1中相同體積的75%乙醇重懸沉淀，對稱裝入離心機(jī)中，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取出冷凍管，用移液器吸去上清液，保留沉淀。4.3.4.3 重復(fù)步驟4.3.4.2。4.3.4.4 將裝有DNA沉淀物的冷凍管放在操作臺上自然揮發(fā)多余的乙醇溶液，或?qū)⒗鋬龉茈x心以加快DNA沉淀物的干燥速度。4.3.5 溶解DNA：向冷凍管中加入TE緩沖液120µl，振蕩混勻，使其充分溶解。4.3.6 保存：將裝有DNA溶液的冷凍管置于5冰箱凍存?zhèn)溆谩?.4 注意事項(xiàng)4.4.1 步驟4.3.1.5得到的沉淀應(yīng)為略帶有粉紅色的白色物質(zhì)。若得到的沉淀大部分呈粉紅色或紅色，可重復(fù)步驟4.3.1.5。4.4.2 步驟4.3.2.2得到的液體若粘稠度較小，可適量再加入一些NLB和SDS的混合緩沖液。4.4.3 步驟4.3.3.1加入NaCl溶液振蕩混勻后，若沉淀不明顯，可再加入適量NaCl溶液，保證蛋白質(zhì)充分析出。4.4.4