應(yīng)用定量PCR方法快速基因診斷Down綜合征

1、應(yīng)用定量PCR方法快速基因診斷Down綜合征【摘要】目的探討用定量聚合酶鏈反應(yīng)方法對Down綜合征進(jìn)行基因診斷。方法以短串聯(lián)重復(fù)序列(D21S11)作為遺傳標(biāo)記，合成特異引物，用同位素標(biāo)記聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增后對11名正常人(6例外周血，5例羊水)及28例Down綜合征患者(外周血)進(jìn)行定量檢測。結(jié)果11名正常人中10人出現(xiàn)DNA含量為11關(guān)系的2條電泳帶，1人為1條帶。28例患者中24人出現(xiàn)DNA含量21的2條帶，3人為DNA含量為111的3條帶，1人為1條帶。結(jié)論D21S11位點短串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)是對Down綜合征基因診斷很有應(yīng)用價值的遺傳標(biāo)記，應(yīng)用定量聚合酶鏈反應(yīng)方法可在24小時內(nèi)對Down

2、綜合征做出快速、準(zhǔn)確的產(chǎn)前及臨床基因診斷?！娟P(guān)鍵詞】Down綜合征定量聚合酶鏈反應(yīng)基因診斷 Rapid detection of trisomy 21 by quantitative polymerase chain reactionJIN Chunlian*,ZHANG Li, WANG Ruomei, YU Hai,JIANG Li, LIN Changkun, LI Fuchai, SUN Kailai.【Abstract】ObjectiveStudying gene diagnosis of trisomy 21 by means of quantitative polymerase

3、chain reaction.MethodsPolymorphic short tandem repeat(STR) at D21S11 served as the gene marker, and a pair of primers was synthesized. The samples from 11 normal subjects and 28 cases of trisomy 21 were analyzed by quantitative PCR.Results10 normal subjects showed two bands with a ratio of 11, and a

4、 subjects showed one band. Of 28 cases of trisomy 21,24 cases showed two bands with a ratio of 21,3 cases showed three bands with a ratio of 111, and 1 case showed one band. Conclusion Polymorphic STR at D21S11 is a valuable gene marker for diagnosis of trisomy 21.Trisomy 21 can be diagnosed rapidly

5、 and accurately within 24 hours by quantitative PCR.【Key words】Down syndromeQuantitative polymerase chain reactionGene diagnosis先天愚型(Down syndrome,Down綜合征)是一種最常見的染色體病，以先天性智力低下為主要癥狀。主要由于21三體或易位引起q22-ter部分三體所致，其發(fā)病率為1/7001/800。目前臨床主要采用常規(guī)染色體顯帶技術(shù)，能對大多數(shù)患者進(jìn)行診斷，但所需時間長(約23周)，方法較繁瑣，尤其在產(chǎn)前診斷中，羊水細(xì)胞不易培養(yǎng)，不便于大規(guī)模的產(chǎn)前

6、普查。1993年國外報道1，2，采用短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)作為遺傳標(biāo)記，通過熒光標(biāo)記PCR結(jié)合DNA自動分析儀檢測，可對Down綜合征做出快速的基因診斷，但此方法所需儀器較昂貴。為此，我們選用D21S11位點STR多態(tài)作為遺傳標(biāo)記，應(yīng)用放射性標(biāo)記PCR定量方法，探討Down綜合征快速、準(zhǔn)確基因診斷的可行性。1材料和方法1.1材料28例Down綜合征患者及6名正常人外周血，由中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院遺傳室、第二臨床學(xué)院細(xì)胞遺傳室以及兒保門診經(jīng)臨床染色體核型分析診斷后提供，28例Down綜合征患者核型均為21三體型。5份正常羊水(孕620周)由中國醫(yī)科大學(xué)

7、第二臨床學(xué)院婦產(chǎn)科提供。1.2方法用飽和氯化鈉法提取血液白細(xì)胞DNA，煮沸法提取羊水脫落細(xì)胞DNA3，4。PCR反應(yīng)總體積5 l，含基因組DNA 0.1g，引物0.5 mol/L，dNTP100 mol/L。-32P-dCTP 37037Bq，Taq DNA聚合酶0.2 U，經(jīng)9445秒，5835秒，7245秒，31周期循環(huán)后，72延伸7分鐘，擴(kuò)增后加入20 l 1甲酰胺變性示蹤液(95%甲酰胺EDTA，0.05%二甲苯藍(lán)，0.05%溴酚藍(lán))，97變性10分鐘，取24 l至6%變性聚丙烯酰胺凝膠(7 mol/L脲素，ACgBis為191，1TBE)30 80W電泳分離1.52小時，-70放射自

8、顯影612小時。所用引物參照文獻(xiàn)5的方法合成。2結(jié)果2.1D21S11位點STR多態(tài)檢測結(jié)果11名正常人和28例Down綜合征患者中共檢測到7個等位片段，片段長度約為220bp250bp，見1。1D21S11位點STR多態(tài)等位片段中可見AG7個等位片段，6、7為正常人，其它均為患者Fig 1STR polymorphic allele fragment at D21S11Seven polymorphic allele fragments (A to G),6 and 7 are normal persons and others are patients2.211名正常人中10人均為D21S

9、11位點STR多態(tài)雜合子，1人為純合子。2.328例Down綜合征患者D21S11位點STR多態(tài)檢測結(jié)果24人為有2個不同長度等位片段的雜合子，3人為有3個不同長度等位片段的雜合子，1人為有1個等位片段的純合子，見2。2D21S11位點定量PCR檢測結(jié)果1：患者(111)；24、6、7、9：患者(21)；5：患者(純合子)；8：正常人(11)Fig 2Quantitative PCR detection at D21S111:patient(111);2-4，6，7，9：patient(21)；5：patient(homozygote);8:normal person(11)2.4正常人及Do

10、wn綜合征患者等位片段經(jīng)DNA密度儀定量結(jié)果見表1。表1D21S11位點STR等位片段定量結(jié)果Tab 1Quantitative results of STR polymorphic allele fragments at D21S11Sample(樣本)Number of samples(樣本數(shù))Quantitative ratio of twobands of the heterozygote(雜合子兩條帶之間的定量比)Heterozygote(雜合子)Homozygote(純合子)Mean(均數(shù))Standarddeviation(標(biāo)準(zhǔn)差)Range(范圍)Normal diploid(

11、正常二倍體)101.0940.0811.0071.255Trisomy 21(21三體)1-Two bands(2條帶)241.9120.1871.6212.226Three bands(3條帶)3-One band(1條帶)1-3討論 90年代初，國外一些學(xué)者提出用定量PCR方法可對染色體數(shù)目畸變做出基因診斷。這種方法是以特定染色體靶序列的擴(kuò)增為基礎(chǔ)的，即在PCR擴(kuò)增過程的指數(shù)增長階段，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與最初靶DNA的量成比例關(guān)系。選擇某一染色體上特定序列作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測定擴(kuò)增產(chǎn)物量就能確認(rèn)細(xì)胞中存在這一特定染色體數(shù)目，從而診斷出染色體數(shù)目的畸變2。Eggeling等1，5分別

12、選S100B(21號染色體)和IGFI(12號染色體作內(nèi)對照)作為遺傳標(biāo)記，應(yīng)用熒光標(biāo)記技術(shù)和DNA自動分析儀定量分析相結(jié)合的方法，探討用PCR方法快速診斷Down綜合征的可行性，后來Adinolfi等6進(jìn)一步探討了應(yīng)用STR遺傳標(biāo)記進(jìn)行Down綜合征快速診斷的可行性。STR是定量PCR檢測染色體數(shù)目異常最適合的遺傳標(biāo)記6，它廣泛存在于人類基因組內(nèi)，且呈高度多態(tài)性，可提供信息量(PIC)較高，并遵循孟德爾共顯性遺傳等特點。我們選擇的D21S11位點STR為TCTA四核苷酸重復(fù)序列多態(tài)，它位于21q21，與Down綜合征核心區(qū)緊密連鎖。分析了11名正常人和28例Down綜合征患者，共檢測到7個等

13、位片段，其長度為220bp250bp。Mclnnis等7報道分析535名正常人和患者，共檢測到12個等位片段，與我們的結(jié)果有一定差異，這可能與我們檢測的標(biāo)本數(shù)少有關(guān)。我們檢測到的實際雜合子率為94.8%(37/39)。分析的11名正常人D21S11位點STR結(jié)果，10人均出現(xiàn)2個擴(kuò)增帶，經(jīng)DNA密度儀定量2條帶的比率近似11(1.094)。只有1例是純合子，即只出現(xiàn)1條擴(kuò)增帶。Down綜合征患者28例中3例呈3條帶，擴(kuò)增的DNA量呈111，24例呈現(xiàn)2條帶，其密度比率近似21(1.912)，僅有1例呈現(xiàn)1條帶，即3個等位基因純合型。本研究結(jié)果表明，應(yīng)用該多態(tài)位點定量PCR方法能對96.4%(2

14、7/28)的Down綜合征作出診斷，而且擴(kuò)增的2條等位片段可互為對照，肉眼觀察就能判定與密度儀器定量(21)基本一致的結(jié)果。我們應(yīng)用同位素-32P-dCTP標(biāo)記PCR擴(kuò)增法結(jié)合DNA密度儀掃描定量，能簡便快速定量診斷，與熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增后DNA自動分析儀分離并定量方法相比較，所用成本低，儀器設(shè)備簡單，能直觀地肉眼判定，更具有推廣應(yīng)用意義。我們體會到，同位素?fù)饺敕ǖ腜CR循環(huán)周期數(shù)非常重要，是定量可靠的關(guān)鍵，在本實驗條件下擴(kuò)增循環(huán)31周期較為理想。Pertl等5報道，在熒光標(biāo)記結(jié)合DNA自動分析儀定量檢測76例患者中，有1例呈現(xiàn)不規(guī)則的峰，可能系患者為嵌合型所致。定量PCR方法的不足在于對嵌合

15、體不能做出準(zhǔn)確診斷，我們所選擇的標(biāo)本都是21三體型，因而未遇到這種異常的帶型，但在實際應(yīng)用中不能忽視這一點。本課題受遼寧省科委(96802002)資助作者單位：金春蓮于海姜莉林長坤李福才孫開來（110001沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室）王若梅（第一附屬醫(yī)院兒科）張勵（中國人民解放軍大連醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物教研室）*為通信聯(lián)系人參考文獻(xiàn)1Eggeling F, Fregtag M, Fahsold R,et al.Rapid detection of trisomy 21 by quantitative PCR.Hum Genet,1993,91(6)567-570.2Pertl B, Y

16、au SC, Sherlock J, et al.Rapid molecular method for prenatal detection of Downs syndrome. Lancet,1994,343(8907)1197-1198.3林長坤，姜莉，張勵，等.一種實用的基因組DNA提取方法及應(yīng)用.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1998，27(4)440-441.4Kogan SC,Doherty M, Citschier J,et al.An improved method for prenatal diagnosis of genetic diseases by analysis of amplified DNA sequence. N Engl J Med,1987,317(16)985-990.5Pertl B, Kopp WS, Kroisel PM,et al.Rapid detection of trisowis 21 and 18 and sexing by quantitative fluoescent multiplex PCR.Hum Genet,1996,98(1)55-59.6Adinolfi M, Sherlock J, P