實驗(三)厚薄血膜涂片法檢測病原體

1、實驗（三）厚薄血膜涂片法檢測病原體實驗目的：1、 掌握班氏和馬來絲蟲微絲蚴、布氏姜片吸蟲成蟲及蟲卵的形態(tài)結構。2、 掌握厚薄血膜涂片法操作過程及應用3、 加深絲蟲和布氏姜片吸蟲的有關理論內(nèi)容。4、 了解布氏姜片吸蟲成蟲的形態(tài)。實驗內(nèi)容：1、 復習絲蟲、布氏姜片吸蟲的有關理論內(nèi)容。2、 觀察班氏微絲蚴、馬來微絲蚴的玻片標本；觀察布氏姜片吸蟲蟲卵。3、 小白鼠尾取血厚薄血膜涂片法操作，瑞氏染色鏡檢。4、 觀察布氏姜片吸蟲的成蟲大體標本。5、 作業(yè)：畫出班氏微絲蚴、馬來微絲蚴、布氏姜片吸蟲蟲卵的形態(tài)。微絲蚴班氏微絲蚴馬來微絲蚴大小244296×537177230×56體態(tài)柔和，彎

2、曲自然，無小彎彎曲僵硬，大彎上有小彎頭間隙（長寬）較短，11或12較長，21體核較小，分布均勻，清晰可數(shù)較大，排列緊密，相互重疊，不宜分清尾核無有2個尾核，前后排列，尾核出角皮膨大布氏姜片吸蟲成蟲（染色標本） （l）蟲體呈長橢圓形，前端略尖，后端鈍圓，背面稍隆起，腹面扁平，較肥厚。長2075mm，寬820mm，厚0.53mm。 （2）口吸盤位于蟲體亞頂端；腹吸盤靠近口吸盤，呈漏斗狀，較大，肌肉發(fā)達，比口吸盤大 45倍，肉眼可見。 （3）消化道有口、咽、食道和腸支。腸支在腹吸盤前分為兩支，呈波浪狀向后延伸至蟲體末端，形成盲管。 （4）雌雄同體。兩個睪丸前后排列，高度分支呈珊瑚狀，占據(jù)蟲體的后半部

3、。 卵巢分支，位于睪丸與子宮之間，以輸卵管與卵模相通。卵模位于睪丸前的體中橫線上，外有梅氏腺包繞，有勞氏管，無受精囊。卵黃腺發(fā)達，分布于蟲體兩側，從腹吸盤以下直至蟲體末端。生殖孔位于腹吸盤前緣。布氏姜片吸蟲卵 為寄生于人體最大的蟲卵。大小為130140×8085m，淡黃色，橢圓形，卵殼薄而均勻，一端有一不明顯的卵蓋，卵內(nèi)含一個卵細胞和2040個卵黃細胞。厚薄血膜涂片法：常用于絲蟲病，瘧原蟲的檢測。操作方法：   (1)采血：采血時間  在普查時，一般無法考慮采血時間。在臨床上，對現(xiàn)癥病人一般可隨時采血，但為了提高檢出率，就應當考慮采血的適當時間。對典型發(fā)

4、作的間日瘧及三日瘧患者，應選擇發(fā)作后數(shù)小時至10余小時采血為好。此時瘧原蟲發(fā)育至環(huán)狀體乃至大滋養(yǎng)體，蟲體大，瘧色素已形成，受染紅細胞也出現(xiàn)變化，有利于瘧原蟲的檢出。惡性瘧原蟲大滋養(yǎng)體和裂殖體是在皮下、脂肪和內(nèi)臟微血管中發(fā)育的，通常在外周血液中不易查到，配子體在環(huán)狀體出現(xiàn)1周后方能見于外周血液，故在發(fā)作時采血。 采血部位  從患者耳垂或指尖（以左手無名指為宜）取血，嬰兒通常從大姆趾第二趾骨腹面針刺采血。采血方法  用75%乙醇棉球消毒取血部位皮膚，待干后用左手拇指和食指捏住采血部位，右手持針迅速刺入皮膚，待血液流出或輕輕擠出血滴，供制作涂片用，采血完畢用干棉球輕壓傷口止血。(

5、2)制片：薄血膜的制作  取1滴血于1張潔凈的載玻片上，選1張邊緣平整、光滑的載玻片作推片，用左手拇指和中指夾持其兩端，將推片的邊緣中點與血滴接觸，并與載玻片呈30o45o夾 角，待血滴沿推片邊緣向兩側展開后，立即由右向左迅速推成薄血膜。理想的薄血膜要求紅細胞均勻地鋪成一層，無裂痕，其末端凸出呈舌尖形。注意：推片時用力 和速度要均勻，不能中途停頓或重復推片，以免造成血膜斷裂或厚薄不勻。如取血量多，夾角宜??；取血量小，則夾角可大些。厚血膜的制作  用推片的一角接觸刺血點上的血滴，取血2滴，置載玻片上，并從里向外作旋轉(zhuǎn)涂布，使成直徑為0.8cm大小的圓形血膜，厚薄要均勻，然后平

6、置桌上，待自然干燥。厚薄血膜同片制作  用目測法將載玻片從右到左等分成6格，厚血膜涂在第3格中央，薄血膜涂在第4格前緣至第6格中部，第1、2格可用于貼標簽，制作厚、薄血膜方法同上。(3)染色：瑞氏染色法（Wrightstaining）  厚血膜需先溶血，溶血方法為：滴加數(shù)滴蒸餾水于厚血膜上，使紅細胞溶解，待血膜呈灰白色時，將水倒去，晾干。取制作好的血片，在血膜兩端用玻璃蠟筆各劃一豎線，滴加瑞氏染液數(shù)滴，使其布滿血膜，染液中含甲醇，約0.51分鐘將血膜固定，然后加等量緩沖液或蒸餾水，輕搖載玻片，使之與染液混勻，很快液面出現(xiàn)燦銅色膜，約經(jīng)35分鐘染色后，用緩沖液、蒸餾水或自來水

7、沖洗。注意：切勿傾去染液再用水沖洗，以免血膜上沉著染料顆粒，影響鏡檢。如厚、薄血膜涂在同一張載玻片上，先在厚、薄血膜中間及兩側用蠟筆各劃一條豎線，滴蒸餾水于厚血膜上，使之溶血，待血膜干后，與薄血膜一起染色。吉氏染色法（Giemsastaining）  取吉氏染液原液，用pH7.07.2的磷酸緩沖液稀釋1020倍。厚血膜不需固定，薄血膜先用甲醇固定（如厚血膜在同一張載玻片上，切勿延及厚血膜），干后滴加稀釋的吉氏染液，布滿血膜（如大批染片，可置入染色缸），染2030分鐘，沖洗，晾干后鏡檢。稀釋的染液，宜用時現(xiàn)配，否則易產(chǎn)生沉淀，影響染色效果，大批染片時，應根據(jù)染色時的條件，如不同病人的血

8、片，染色時的室溫、染液稀釋程度、沖洗水的pH值等情況的不同，先試染少量血片，摸索出染色效果最佳的時間和條件，再大批染片。此外，染色時間應隨染液稀釋情況作適當?shù)恼{(diào)整，染液濃度高，染色時間可短些，反之則長。吉氏染液配制：吉氏染劑粉1g，甘油50ml，甲醇50ml。將染劑粉置研缽中，加少量甘油，充分研磨，再邊加甘油邊研磨，直至甘油用完。然后加少量甲醇，研磨后倒入棕色瓶中，剩余的甲醇分幾次沖洗研缽中的染液，全部倒入瓶內(nèi)，塞緊瓶塞充分搖勻，置65溫箱內(nèi)24小時或室溫下1周后過濾，即成原液。瑞氏染色法操作簡便、快速，臨床上經(jīng)常使用，因甲醇易于蒸發(fā)，如掌握不當可能在血膜上產(chǎn)生沉淀，妨礙觀察。同時染色結果也不

9、大一致，在較熱的環(huán)境中較易褪 色，保存時間較短。吉氏染色法染色效果良好，對厚血膜尤佳。經(jīng)稀釋后的染液對厚血膜兼有溶血和染色的雙重作用。染色后，瘧原蟲細胞核和細胞質(zhì)紅藍分明，很 少出現(xiàn)沉淀，不易褪色。適用染大批血片標本，供教學使用，但染色需時較長。(4)鏡檢  在檢查薄血膜過程中，有時遇見與瘧原蟲形態(tài)類似的物體，應注意區(qū)別排除。如單個血小板附于紅細胞上，易誤認為環(huán)狀體或成長中的滋養(yǎng)體。成堆的血小板誤以為成熟的裂殖體。血小板的形狀多樣，或呈圓形，卵圓形，有時呈不規(guī)則多角形，其長徑約為紅細胞的1/31/4。 血小板中央部常呈紫紅色顆粒狀結構，周邊部分著色淺，但不如瘧原蟲紫紅色胞核與淺藍色胞質(zhì)分得清楚。此外，還有染色液沉淀顆粒以及偶有細菌、霉菌、塵粒、 白細胞碎片重疊于紅細胞上，很像環(huán)狀體和成長中的滋養(yǎng)體。但這些物質(zhì)大多呈一種顏色，如細調(diào)顯微鏡焦距，可以看出它們與紅細胞不在同一水平面上。厚血膜中 瘧原蟲比較集中（一個視野可見到的細胞數(shù)約相當于20個 薄血膜視野），但厚血膜經(jīng)溶血后，紅細胞輪廓已消失，原