骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血的研究進(jìn)展

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血的研究進(jìn)展         11-01-12 13:14:00     作者：李娟 劉黎青 周盛年    編輯：studa20【關(guān)鍵詞】  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；移植；腦缺血缺血性腦血管病嚴(yán)重威脅著人類健康，具有發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高等特點(diǎn)。目前腦缺血的治療手段主要有溶栓、抗凝及應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑等，但不能從根本上切實(shí)有效的修復(fù)受損腦組織。近年來骨髓基質(zhì)干細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于移植研究中，尤其是對于腦缺血等各

2、種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，更是成為研究的熱點(diǎn)。作為細(xì)胞治療的細(xì)胞來源之一，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化潛能好、來源豐富、不存在胚胎干細(xì)胞移植所帶來的倫理學(xué)問題，又可用于自體移植，免除了宿主可能的免疫排斥反應(yīng),具有良好的應(yīng)用前景1。1  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性    骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有自我更新2和多向分化能力3。在生理穩(wěn)態(tài)情況下，體內(nèi)大多數(shù)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖不明顯，但在體外補(bǔ)充適量血清的培養(yǎng)液中，它們能貼壁生長，表現(xiàn)出旺盛的有絲分裂活動和增殖能力。大量研究證實(shí)，在一定誘導(dǎo)條件下骨髓基質(zhì)干細(xì)胞可向成骨細(xì)胞4，5、成軟骨細(xì)胞6、成肌細(xì)胞7、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞等中

3、胚層細(xì)胞分化;同時骨髓基質(zhì)干細(xì)胞還可以向外胚層的神經(jīng)細(xì)胞8和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞分化9。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是細(xì)胞移植治療腦缺血等各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病理想的細(xì)胞來源10。2  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)    目前常用的分離方法主要有三種：密度梯度離心法、貼壁培養(yǎng)篩選法和流式細(xì)胞儀分選法。密度梯度離心法，是根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同，利用細(xì)胞分離液通過離心分層，將有核細(xì)胞和血細(xì)胞分離的方法。具有操作簡便，所得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞純度較高，對活性影響小等特點(diǎn)。貼壁培養(yǎng)篩選法，即根據(jù)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的黏附貼壁生長而血細(xì)胞在培養(yǎng)液中懸浮生長的特性上的差異，通過定期換液除去不貼壁

4、細(xì)胞，從而達(dá)到純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的目的。此法操作簡單，但獲得的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞純度低，混雜細(xì)胞較多。流式細(xì)胞儀法，是利用免疫學(xué)方法應(yīng)用流式細(xì)胞儀識別已標(biāo)記的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，將所需細(xì)胞進(jìn)行分離的方法。由于此方法試劑、儀器價格昂貴，技術(shù)要求較高而且分選過程中可造成細(xì)胞損傷和死亡、經(jīng)過此法分選的細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢等問題，目前尚未廣泛應(yīng)用。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)目前多采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法。培養(yǎng)條件為利用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素的LDMEM培養(yǎng)基，置于37、5% CO2、80%濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的移植途徑、移植數(shù)量、移植時機(jī)3.1&

5、#160; 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的移植途徑 目前骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血的途徑有3種:靜脈途徑、動脈途徑、腦內(nèi)局部注射。靜脈途徑：靜脈輸入骨髓基質(zhì)干細(xì)胞選擇性遷移至腦缺血區(qū)的機(jī)制可能為血腦屏障的破壞有利于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞選擇性進(jìn)入缺血半球，卒中后局部的微脈管系統(tǒng)表達(dá)黏附因子吸引炎性細(xì)胞及血管中的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向損傷區(qū)遷移11。動脈途徑：可將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞直接經(jīng)缺血側(cè)頸內(nèi)動脈注入。其較腦內(nèi)注射侵襲性小，較為安全，移植細(xì)胞在損傷區(qū)的存活率也較腦內(nèi)注射高。但動脈途徑與靜脈途徑一樣，都屬于全身輸注，因此不可避免地會播散到身體其他器官。腦內(nèi)局部注射：根據(jù)缺血損傷的部位采用腦立體定向術(shù)，將一定體積、

6、適當(dāng)數(shù)量的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞直接注射到缺血損傷部位。此途徑具有可以將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞直接送達(dá)缺血部位，提高移植物抵達(dá)靶點(diǎn)的數(shù)量的特點(diǎn)。但其對腦組織產(chǎn)生一定的損傷;移植物的數(shù)量受一定程度的限制;不便多次多靶點(diǎn)注射12。3.2  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的移植數(shù)量 移植骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外的傳代次數(shù)多會影響其生物學(xué)活性，而移植細(xì)胞數(shù)量的增多會加大對其安全性的顧慮，移植的細(xì)胞數(shù)量過少又難以起到治療的作用。Chen等13的研究發(fā)現(xiàn)靜脈移植1×106骨髓基質(zhì)干細(xì)胞對MCAO大鼠的功能恢復(fù)無明顯作用，而3×106組則顯示了明顯的功能改善。有體外擴(kuò)增骨髓基質(zhì)干細(xì)胞自體移植治療大腦中動

7、脈供血區(qū)梗死病人的臨床研究報(bào)道，Bang OY等14對病人經(jīng)靜脈途徑自體移植了1×106個細(xì)胞，移植后癥狀明顯改善，而且觀察一年未發(fā)現(xiàn)與移植相關(guān)的不良反應(yīng)。目前多移植1×1061×107個骨髓基質(zhì)干細(xì)胞用于恢復(fù)神經(jīng)功能。3.3  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的移植時機(jī) 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植時間點(diǎn)的選擇要綜合考慮，必須考慮到腦損傷的自然恢復(fù)過程，延遲到缺血后恢復(fù)的自然穩(wěn)定期，但過分延長移植的等待時間，會導(dǎo)致瘢痕組織形成，不利于移植。目前在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血的動物研究中，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植時間為缺血模型建立后128 d不等。4  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

8、移植治療腦缺血的機(jī)制    可能機(jī)制有以下幾個方面：細(xì)胞替代作用15：移植入腦組織的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞通過分化為神經(jīng)細(xì)胞，重建了局部神經(jīng)環(huán)路，代償了損傷細(xì)胞的功能，即認(rèn)為是干細(xì)胞發(fā)揮了“替代”作用。Englund等16發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植入大鼠腦內(nèi)后分化的細(xì)胞具有神經(jīng)元形態(tài)和表面標(biāo)志，與鄰近神經(jīng)元形成廣泛連接，并觀察到了新生神經(jīng)元產(chǎn)生的動作電位。Wang等17研究顯示單核細(xì)胞趨化蛋白1能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞遷入缺血的腦組織。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞通過血腦屏障向病變部位遷移，對周圍環(huán)境、細(xì)胞因子和一些信號作為反應(yīng)，與周圍組織發(fā)生聯(lián)系，表達(dá)神經(jīng)元特有的標(biāo)志蛋白，如微管聯(lián)合蛋白2、

9、神經(jīng)元特性烯醇化酶、神經(jīng)絲和膠質(zhì)纖維酸性蛋白等。與病變周圍組織滲透融合、替代損傷細(xì)胞、重建神經(jīng)環(huán)路，從而達(dá)到恢復(fù)神經(jīng)功能的目的。分泌各種營養(yǎng)因子:研究表明，缺血性大腦組織的提取物能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和肝細(xì)胞生長因子(HGF)，而且這些營養(yǎng)因子的增加與腦缺血時間呈依賴關(guān)系18。NGF能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特定神經(jīng)元的存活和分化，并在腦損傷后的神經(jīng)可塑性、再生潛能及神經(jīng)凋亡的抑制中扮演重要角色19;BDNF促進(jìn)軸突生長20、提高神經(jīng)存活及抗損傷能力。通過拮抗興奮性氨基酸毒性、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、

10、減少自由基損傷、抑制細(xì)胞凋亡等對神經(jīng)細(xì)胞具有重要的保護(hù)作用和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)作用21。促進(jìn)缺血區(qū)新血管再生：血管新生與功能恢復(fù)有關(guān)，因?yàn)檠苄纬墒钦＝M織修復(fù)中不可缺少的過程22。Chen等23通過靜脈給大腦中動脈栓塞24 h的大鼠注射人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，用激光掃描共聚焦顯微鏡、免疫組織化學(xué)及ELISA方法分析缺血邊緣帶的血管發(fā)生和宿主腦內(nèi)的VEGF及其受體水平，發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)大鼠腦內(nèi)血管發(fā)生，可能與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增加了內(nèi)源性VEGF及其受體水平有關(guān)。Chen等24將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植入永久性局灶性腦缺血模型大鼠，14 d后發(fā)現(xiàn)移植大鼠的神經(jīng)功能顯著改善，凋亡細(xì)胞明顯減少及微血管密

11、度的顯著增加。促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖：在成年哺乳動物室管膜下區(qū)、海馬齒狀回的顆粒下區(qū)，甚至在其他部位，比如紋狀體、脊髓、大腦皮質(zhì)都存在著具有神經(jīng)再生能力的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞。Chen等25給短暫性大腦中動脈閉塞的雌性大鼠靜脈注射雄性大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，通過Y染色體標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn)，移植細(xì)胞能在宿主腦內(nèi)存活并向同側(cè)缺血半球集中，與對照組相比，移植組側(cè)腦室下區(qū)的溴脫氧尿苷（BrdU）陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。     11-01-12 13:14:00     作者：李娟 劉

12、黎青 周盛年    編輯：studa205  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血存在的問題和展望  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植治療腦缺血的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)步，但仍然存在一些問題和爭論有待我們研究探討:骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞后，是否具有神經(jīng)細(xì)胞的一系列功能，盡管有些實(shí)驗(yàn)做出了分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞的電生理的功能指標(biāo)，但是各個實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)條件不同，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，故這些結(jié)果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在宿主體內(nèi)分化為神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量有多少，存活時間有多長，如何提高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)的成活率和向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的能力。細(xì)胞移植后能否整合入宿

13、主的神經(jīng)環(huán)路，能否與其他神經(jīng)元產(chǎn)生突觸聯(lián)系進(jìn)而分泌神經(jīng)遞質(zhì)，能否與其他神經(jīng)細(xì)胞之間建立精確的聯(lián)系。目前的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的移植實(shí)驗(yàn)為先在體外誘導(dǎo)分化為相應(yīng)組織細(xì)胞后再植入人體內(nèi)，倘若對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化操作會改變細(xì)胞特性，是否有發(fā)展為腫瘤可能。    骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有取材方便，擴(kuò)增迅速，多向分化潛能等特點(diǎn)26，尤其在自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植中克服了諸如倫理、免疫排斥等問題。因此，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在治療缺血性腦損傷中具有廣闊的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Corti S，Nizzardo M,Nardim M,et al.Neural stem cell tran

14、splantation can ameliorate the phenotype of a mouse model of spinal muscular atrophyJ. Clin Invest，2008；118(10):331630.2 SilaAsna M，Bunyaratvej A，Maeda S,et al.Osteoblast differentiation and bone formation gene expression in strontiuminducing bone marrow mesenchymal stem cellJ.Kobe J Med Sci，2007；53

15、（12）:2535.3 Lin HT，Tarng YW，Chen YC,et al.Using human plasma supplemented medium to cultivate human bone marrowderived mesenchymal stem cell and evaluation of its multiplelineage potentialJ.Transplant Proc，2005；37(11):45045.4 Gopalakrishnan V，Vignesh RC，Arunakaran J,et al.Effects of glucose and its

16、modulation by insulin and estradiol on BMSC differentiation into osteoblastic lineagesJ.Biochem Cell Biol，2006；84（1）:93101.5 Lisheng W，Meng E，Guo Z.High mobility group box1 protein inhibits the proliferation of human mesenchymal stem cells and promotes their migration and differentiation along osteo

17、blastic pathwayJ.Stem Cells Dev，2008；17(4)：80513.6 Curran JM，Tang Z，Hunt JA.PLGA doping of PCL affects the plastic potential of human mesenchymal stem cells:both in then presence and absence of biological stimuliJ.J Biomed Mater Res A，2009；89(1)：112.7 Gang EJ，Bosnakovski D，Simsek T,et al.Pax3 activa

18、tion promotes the differentiation of mesenchymal stem cells toward the myogenic lineageJ.Exp Cell Res，2008；314(8):172133.8 Mercedes Zurita，Celia Bonilla，Laura Otero,et al.Neural transdifferentiation of bone marrow stromal cells obtained by chemical agents is a shorttime reversible phenomenonJ.Neuros

19、cience Research，2008；60（3）:27580.9 Stock P，Staege MS，Muller LP,et al.Hepatocytes derived from adult stem cellsJ.Transplant Proc，2008；40(2):6203.10 Wang HY，Zhu XF，Wang LM,et al.Brainderived neurotrophic factor and neural stem cells transplantation in treatment of hypoxicischemic brain injury in ratsJ.Zhonghua Er Ke Za Zhi，2008；46(7):5449.11 Hill WD，Hess DC，MartinStuddard A.SDF1(CACL12) is upregulated in the ischemic penumbra following stroke:association with bone marrow cell homing to injuryJ.Neuropathol Exp Neurol，2004；63(1):8496.12 Li Y，Chopp