丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)及其臨床應(yīng)用進(jìn)展

1、丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)及其臨床應(yīng)用進(jìn)展    【摘要】：象其它傳染病一樣，丙型肝炎是社會(huì)醫(yī)學(xué)工作者所面臨的又一個(gè)重要課題：目前，全球約有2億人感染丙肝，其中在發(fā)展中國(guó)家的感染率     【摘要】：象其它傳染病一樣，丙型肝炎是社會(huì)醫(yī)學(xué)工作者所面臨的又一個(gè)重要課題：目前，全球約有2億人感染丙肝，其中在發(fā)展中國(guó)家的感染率、發(fā)病率尤高。美國(guó)疾病控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）在2000年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，美國(guó)有一萬(wàn)人死于丙肝感染；據(jù)估計(jì)，到2010年，丙肝的

2、死亡率將可能超過艾滋病。    19881989年，對(duì)引起非甲非乙型肝炎（Non-A and non-B hepatitis，NANBH）的病原體研究取得了突破性進(jìn)展，從一患有慢性NANBH的黑猩猩外周血中分離得到的一種RNA病毒揭開了丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）的研究序幕；利用該段特異序列，表達(dá)了一個(gè)特異性克隆，并得到了一個(gè)可延長(zhǎng)的融合蛋白（C100）。美國(guó)強(qiáng)生OCD公司（Ortho-Clinical Diagnostics，a Johnson & Johnson company）利用該蛋白作為包被抗原、以酶聯(lián)免疫

3、吸附實(shí)驗(yàn)技術(shù)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）為基礎(chǔ)，研制出了最初的第一代商業(yè)性抗-HCV臨床檢測(cè)試劑；同時(shí)，OCD與其合作伙伴美國(guó)凱榮公司（Chiron Corporation）共同在全世界范圍內(nèi)享有抗-HCV檢測(cè)的專利權(quán)。 近十幾年來，OCD公司不斷努力，先后又研制出了抗-HCV的ELISA二代、三代檢測(cè)試劑并推向市場(chǎng)；隨著這些高質(zhì)量檢測(cè)試劑的研制成功及其在獻(xiàn)血員篩查中的廣泛應(yīng)用，世界范圍內(nèi)輸血后HCV感染的發(fā)生率已經(jīng)大大下降，從而為安全輸血提供了可靠的保證。    一. 抗-HCV IgG檢測(cè) 目前對(duì)

4、HCV抗體主要以檢測(cè)IgG為主，所采用的均為間接法；IgM類抗體的檢測(cè)主要用于一些臨床研究。 1. 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） 檢測(cè)原理：ELISA檢測(cè)抗-HCV IgG系利用固定在固相載體（如普通酶標(biāo)板、聚苯乙烯試管及小球、磁性微粒子等）上的HCV重組表達(dá)和/或人工合成多肽抗原，捕捉待測(cè)樣品中的抗-HCV IgG，然后，通過加入酶（辣根過氧化物酶HRP、堿性磷酸酶ALP等）標(biāo)記的抗-人IgG檢測(cè)所捕捉到的特異性抗-HCV IgG。重組、合成抗原的不同組合方式可能產(chǎn)生不同的檢測(cè)結(jié)果，另外，由于樣品中的其它IgG和固相載體之間的非特異性結(jié)合，也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果。 第一代試劑利用來自HC

5、V病毒基因組中的部分NS3和NS4區(qū)重組表達(dá)抗原（C100）作為固相包被進(jìn)行檢測(cè)；第二代試劑利用來自HCV基因組NS3區(qū)的C33C和部分NS4區(qū)的融合表達(dá)抗原（C200）、再加上C區(qū)的核心抗原C22-3作為固相包被進(jìn)行檢測(cè)；第三代試劑在第二代抗原的基礎(chǔ)上，又加入了來自NS5區(qū)的重組表達(dá)抗原，另外，部分公司的產(chǎn)品中又引進(jìn)了合成肽抗原（圖1）。 臨床意義：該方法目前被廣泛用于獻(xiàn)血員中的HCV感染篩查和臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，抗-HCV檢測(cè)陽(yáng)性提示接觸過病毒；對(duì)大部分病例而言，抗-HCV陽(yáng)性常伴有病毒核酸HCV RNA的存在，因此，抗-HCV是判斷HCV感染的一個(gè)重要標(biāo)志?？?HCV陽(yáng)性而血清中沒有HCV

6、RNA提示既往感染；在極少數(shù)病例中，沒有抗-HCV仍可檢測(cè)到HCV RNA。另外，某些慢性感染者的抗-HCV可持續(xù)存在。 第一代抗-HCV IgG試劑盒所應(yīng)用的抗原來自病毒基因組非結(jié)構(gòu)區(qū)（C100），用其對(duì)獻(xiàn)血員進(jìn)行篩查后，使輸血后HCV的感染率下降了80%以上。但其缺陷主要是：靈敏度低，抗體檢出時(shí)間較晚，且C100抗體有可能出現(xiàn)間歇性陽(yáng)性；非特異性反應(yīng)較高。第二代試劑除上述C100抗原外，又加入了HCV核心區(qū)多肽C22-3和非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原C33C。抗-C22-3和抗-C33C感染后出現(xiàn)較早，而且，核心區(qū)抗原C22-3與NS3區(qū)C33C抗原無(wú)論在早期診斷及靈敏度和特異性等方面均優(yōu)于C100，以上

7、抗原聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高檢出率。第三代試劑比第二代試劑更靈敏、更特異，以O(shè)CD公司的抗-HCV ELISA檢測(cè)試劑為例，其第一代、第二代、第三代試劑的“窗口期”（即HCV感染早期、抗體陰性而無(wú)法檢出的時(shí)期）分別為平均150天、82天、70天。第三代試劑的改進(jìn)主要在于：核心區(qū)抗原比例相對(duì)下降，而相應(yīng)地增加了NS3區(qū)C33C的比例，優(yōu)化了試劑盒的組裝工藝；利用現(xiàn)代基因重組技術(shù)，對(duì)一些重要抗原采用更好的表達(dá)、純化系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)和純化，對(duì)相應(yīng)的基因片段進(jìn)行了重新定位，利用各種先進(jìn)的生產(chǎn)工藝，使包被抗原的免疫活性更強(qiáng)，從而提高了檢測(cè)的靈敏度，減少了非特異性反應(yīng)；加入了NS5區(qū)抗原。因此，第三代試劑不僅能更

8、早地發(fā)現(xiàn)HCV感染者，而且提高了低危人群（如無(wú)償獻(xiàn)血員）檢測(cè)的特異性；隨著第三代試劑的應(yīng)用，抗-HCV假陽(yáng)性結(jié)果已大大減少。 在抗-HCV的ELISA測(cè)定中，確定合適的Cut off值對(duì)減少假陽(yáng)性、假陰性具有重要意義；Cut off值的上移或下移，可導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。Cut off值的確定就是要使依其得到的測(cè)定結(jié)果假陽(yáng)性和假陰性發(fā)生率均為最低，也就是說，應(yīng)找到一個(gè)最佳的“平衡點(diǎn)”，使假陰性和假陽(yáng)性達(dá)到最佳平衡；而處于Cut off值附近的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑，亦即ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”。    抗-HCV ELISA試劑所用抗原 &

9、#160;       結(jié)構(gòu)區(qū)   非結(jié)構(gòu)區(qū)    5'NCR C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5 3'NCR         第一代         C100     第二代 C22-3   C200（C33C + C100） &

10、#160;  第三代 C22-3   C200（C33C + C100） NS5     2. 凝集實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)原理：凝集實(shí)驗(yàn)（Particle agglutination，PA）系利用HCV抗原所包被的乳膠等微粒子和待測(cè)血清進(jìn)行反應(yīng)、通過觀察乳膠微粒體凝集現(xiàn)象的發(fā)生來反映待測(cè)樣品中抗-HCV的有無(wú)。PA試劑價(jià)格低廉、檢測(cè)中不需要特殊的儀器設(shè)備（目測(cè)即可判定結(jié)果），因此，適用于發(fā)展中國(guó)家抗-HCV在獻(xiàn)血員中的大范圍篩查；但靈敏度可能略低于ELISA。 臨床意義：與ELISA實(shí)驗(yàn)相同。 3. 放射免疫實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)原理：與

11、ELISA實(shí)驗(yàn)基本相同，用HCV不同片段的重組表達(dá)抗原和/或合成多肽抗原包被固相載體，與待測(cè)樣品中的抗-HCV反應(yīng)后，加入放射性核素（如125I）標(biāo)記的羊抗-人IgG，洗滌、去除未結(jié)合的放射性標(biāo)記物后，通過計(jì)數(shù)器測(cè)定每份樣品的cpm值。該方法操作復(fù)雜、存在放射性污染，需要配置特殊的計(jì)數(shù)器，因此，應(yīng)用不十分普及。 臨床意義：與ELISA實(shí)驗(yàn)相同。 4. 快速檢測(cè)技術(shù) 檢測(cè)原理：將HCV不同片段的抗原固化在硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜、尼龍膜等載體上，然后，應(yīng)用免疫滲濾或免疫層析技術(shù)與待測(cè)血清進(jìn)行反應(yīng)、以酶（HRP、ALP等）或膠體金、膠體硒等標(biāo)記的二抗作為示蹤物檢測(cè)抗-HCV的存在。該方法的反應(yīng)時(shí)

12、間短（一般為十幾分鐘）、操作簡(jiǎn)便、不需要特殊的儀器設(shè)備、結(jié)果判斷簡(jiǎn)單，也很方便單人份測(cè)定。因此，適用于急診、口腔科室和鄉(xiāng)村醫(yī)療機(jī)構(gòu)等小型實(shí)驗(yàn)室對(duì)抗-HCV的檢測(cè)；缺點(diǎn)是試劑價(jià)格略高，不適于批量樣品的測(cè)定，而且，不同廠家試劑質(zhì)量差異較大。 臨床意義：與ELISA實(shí)驗(yàn)相同。 5. 其它檢測(cè)技術(shù) 如熒光偏振免疫技術(shù)（Fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）、時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)（Time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）、化學(xué)發(fā)光（Luminescent immunoassay，LIA）、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（En

13、hanced chemiluminescence，EC）等。與ELISA技術(shù)的酶促發(fā)色反應(yīng)相比，上述方法在特異性信號(hào)的產(chǎn)生方面有較大改進(jìn)，如酶促發(fā)光（LIA、EC）、熒光激發(fā)（FPIA、TRFIA）等，通過這種改進(jìn)，使檢測(cè)的靈敏度和特異性得到進(jìn)一步提高，目前以上技術(shù)大都采用封閉式全自動(dòng)檢測(cè)模式，比較適用于醫(yī)院對(duì)臨床病人樣品的測(cè)定。 以O(shè)CD公司于20世紀(jì)90年代末期推出的全自動(dòng)免疫分析系統(tǒng)ECi為例，ECi應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)測(cè)定HCV抗體，實(shí)驗(yàn)過程如下：在HCV重組表達(dá)抗原包被的“子彈頭”形小杯中，加入待測(cè)樣品，經(jīng)過37孵育，樣品中的抗-HCV與固相包被抗原相結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，經(jīng)過洗滌，

14、將未參與反應(yīng)的雜蛋白除去；第二步，加入HRP標(biāo)記的二抗，37孵育，標(biāo)記抗體與被固相所“捕獲”的抗-HCV結(jié)合，并被固定在小杯的管壁上，洗滌去除游離的標(biāo)記抗體；最后，加入氧化劑（過氧化氫H2O2）、化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑（3-氯-4-羥基-乙酰苯胺，OCD公司專利）和發(fā)光劑（魯米諾），這時(shí)，結(jié)合在固相上的HRP在H2O2的作用下，將增強(qiáng)劑3-氯-4-羥基-乙酰苯胺氧化成自由基，接著，誘導(dǎo)魯米諾并使之活化、發(fā)光；由于增強(qiáng)劑可以反復(fù)循環(huán)活化，因此，魯米諾能夠連續(xù)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度不斷增加，從而使發(fā)光持續(xù)時(shí)間得以延長(zhǎng)，便于測(cè)定，同時(shí)，檢測(cè)的靈敏度也得到了顯著提高。 臨床意義：與ELISA實(shí)驗(yàn)相同。 6. 補(bǔ)充/確

15、認(rèn)實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)原理：為了對(duì)ELISA篩查實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的樣品進(jìn)行確認(rèn)，Chiron公司又推出了相應(yīng)的補(bǔ)充/確認(rèn)實(shí)驗(yàn)重組免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Recombinant immunoblot assay，RIBA），該實(shí)驗(yàn)是以待測(cè)血清中的HCV抗體和分別固定在硝酸纖維素膜載體上的不同HCV抗原之間的特異性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)、通過再加入酶（一般為ALP）標(biāo)記的二抗來確認(rèn)樣品中抗-HCV的存在和有無(wú)；目前，該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)得到了美國(guó)食品及藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）的認(rèn)可，成為HCV抗體確認(rèn)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)镠CV的各種抗原分別被單獨(dú)固化在載體的不同位置上，因此，該項(xiàng)檢測(cè)又可

16、以區(qū)分待測(cè)樣品對(duì)HCV不同抗原的不同反應(yīng)性。目前，RIBA HCV在全球由OCD公司供貨及提供相關(guān)的技術(shù)服務(wù)。 臨床意義：RIBA目前主要被用于ELISA篩查實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性樣品的HCV抗體確認(rèn)，RIBA實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的患者中，大約75%80%為病毒血癥（即HCV RNA陽(yáng)性）；RIBA實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性而血清中沒有HCV RNA時(shí)提示可能為既往感染者。少數(shù)病例中，抗-HCV的ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性、RIBA實(shí)驗(yàn)單個(gè)抗原陽(yáng)性，即RIBA檢測(cè)結(jié)果為不確定（Indeterminate，IND），此時(shí)無(wú)法確定抗-HCV的感染情況；這種現(xiàn)象可能為HCV急性感染的早期或免疫力低下的患者，也可能為假陽(yáng)性結(jié)果，因此，應(yīng)依據(jù)不同病人的

17、臨床情況、具體加以解釋。另外，由于RIBA實(shí)驗(yàn)可以區(qū)分樣品中的不同HCV抗體成份，因此，在探討HCV不同片段抗體檢出的臨床意義方面也有重要作用（表1）。    表1 HCV各片段抗體檢出的臨床意義     抗體     臨 床 意 義         C    HCV感染后出現(xiàn)很早，陽(yáng)性率也很高；在抗-HCV檢測(cè)中發(fā)揮重要作用  

18、0;  NS3    抗原的免疫原性很強(qiáng)，相應(yīng)的抗體滴度也很高，HCV感染后出現(xiàn)很早，同C區(qū)抗體一樣在抗-HCV的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用     NS4    HCV感染后出現(xiàn)延遲，持續(xù)陽(yáng)性可能與疾病的慢性化有關(guān)     NS5    HCV感染后出現(xiàn)較早，可用于急性期感染的診斷     二. 抗-HCV IgM測(cè)定 檢測(cè)原理：采用間接ELISA法，用基因工程表達(dá)的重組抗原或人工合成的HCV特異性寡肽抗原包被在微孔板內(nèi)，加入待測(cè)血清，如果血清內(nèi)含有抗-HCV IgM，則與之結(jié)合，洗板后再加入HRP標(biāo)記的抗-人鏈F(ab')2片段，最后加底物顯色。 臨床意義：對(duì)于大多數(shù)傳染性病原體而言，IgM型抗體的檢出通常提示急性期感染，但目前對(duì)抗-HCV IgM在HC