淀粉酶的麩曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)

1、實驗二 淀粉酶的麩曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)孟坤鵬 學號：201213410310542012級 生物技術專業(yè) 三班1組摘要：目的：運用麩曲固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)淀粉酶。步驟：孢子懸液的制備，將孢子懸液濃度控制在107個/ml左右，然后在麩曲固態(tài)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，待其顏色由白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色，背面無色時，表明發(fā)酵完成。用蒸餾水將酶與培養(yǎng)基一起溶解離心取上清后及得到酶粗品，運用硫酸銨鹽析法進行酶的提純，最后進行酶活力的測定。關鍵詞 固態(tài)發(fā)酵 淀粉酶 硫酸銨鹽析法引言 米曲霉是一類產(chǎn)復合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等。在淀粉酶的作用下將原料中的直鏈、支鏈淀粉降解為糊精及各種低

2、分子唐磊，如麥芽糖、葡萄糖等。真菌因其獨特的生長、繁殖特點對生長條件的適應性已成為非常優(yōu)異的農(nóng)業(yè)加工副產(chǎn)物（麩皮）的降解菌和酶制劑生產(chǎn)菌。淀粉是植物最主要的貯藏多糖，也是人和動物的重要食物和發(fā)酵工業(yè)的基本原料。淀粉酶屬于水解酶類，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷鍵水解的一類酶的統(tǒng)稱。此類酶廣泛存在于動植物和微生物中。淀粉經(jīng)淀粉酶作用后生成葡萄糖、麥芽糖等小分子物質(zhì)而被機體利用。固態(tài)發(fā)酵法是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上的發(fā)酵方式方法，固態(tài)基質(zhì)中氣、液、固三相并存，即多孔性的固態(tài)基質(zhì)中含有水和水不溶性物質(zhì)。硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)，高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可

3、與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。本實驗以麩皮為主要的發(fā)酵基質(zhì)，豆粉餅為氮源，將米曲霉接種于富含淀粉的培養(yǎng)基中誘導發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶。其中，氮源是合成淀粉酶的原料，而淀粉可以誘導產(chǎn)量的增加，利用鹽析沉淀法對粗酶進行分離純化。酶活力測定：淀粉在淀粉酶的隨機作用下可以被分解為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，淀粉酶催化產(chǎn)生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。1實驗內(nèi)容1.1實驗材料與試劑 菌種：米曲霉（實驗室提供） 試劑：（1）75乙醇 （2）1L PBS緩沖液配方：pH7.4；磷酸二氫鉀(KH2PO4)：

4、0.27g；磷酸氫二鈉(Na2HPO4)：1.42g；氯化鈉(NaCl)：8g； 氯化鉀(KCl)0.2g；加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L。 （3） 1%淀粉溶液（稱取1克可溶性淀粉，溶于100ml pH5.5檸檬酸緩沖液）； pH5.6的檸檬緩沖液： A液（稱取檸檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（稱取檸檬酸鈉29.41克，溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、B液14.5ml混勻即為pH5.5檸檬酸緩沖液； 3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸1.00克，溶于20ml 1mol/L氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入

5、30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾 水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）； 麥芽糖標準液（稱取2克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； 磷酸鹽緩沖液（PH6.8） 取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液250 ml，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118 ml，用水稀釋定容至1000 ml搖勻，即得。 1.2實驗器械 設備：恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、離心機、水浴裝置，高壓蒸汽滅菌鍋，電子天平、電爐、無菌操作臺、721可見光分光光度計 器皿：試管15個、玻璃棒2個、酒精燈1個、稱量紙、膠頭滴管1個、4個250ml錐形瓶、精密pH試紙、細胞計數(shù)板1個、蓋玻片3個、陶瓷缸1個，1ml移液管2個

6、、2ml移液管2個、培養(yǎng)皿8個、離心管8個、100ml燒杯2個、500ml燒杯2個、1000ml燒杯2個、膠皮手套1雙、50ml容量瓶1個、100ml容量瓶2個、比色皿4個、10ml量筒1個、棉繩和報紙、紗布、棉花、涂布棒1個、試管架一個、洗耳球兩個.等1.3實驗方法1.3.1孢子懸液的制備1取包子顆粒溶于無菌水中制得濃度為107個/ml孢子懸液 用血細胞計數(shù)法計數(shù)以確定每毫升孢子數(shù)，方法2： （1）視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋100倍），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。 （2）取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。 （3）將菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺

7、兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上（不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高），然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。 （4）靜置片刻，使細胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。 （5）計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）

8、的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央1個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。為了保證計數(shù)的準確性，避免重復計數(shù)和漏記，在計數(shù)時，對沉降在格線上的細胞的統(tǒng)計應有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規(guī)定計入相應的格中。見右圖：即本格中計數(shù)細胞為3個。（6）每個樣品重復計數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應相差過大，否則應重新操作），按公式計算出每mL（g）菌懸液所含細胞數(shù)量。 16格25格的血球計數(shù)板計算公式：細胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細胞個數(shù)/100400100

9、00稀釋倍數(shù)25格16格的血球計數(shù)板計算公式：細胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細胞個數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)1.3.2制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基（麩曲）制備固體發(fā)酵培養(yǎng)基（麩曲）配方3：（培養(yǎng)皿） 麩皮8g 豆粉餅2g K2HPO43H2O 0.3% MgSO47H2O 0.1% (NH4)2SO4 1% 水 10ml 自然pH配制方法： 依次稱取配方的無機藥品，并依次溶解混合，再加入豆粉餅，最后加入麩皮攪拌均勻。分裝到8個培養(yǎng)基中，壓實按勻。分裝完成后完成后，高壓滅菌鍋121 滅菌20min。 （三）接種 每個培養(yǎng)基接1ml（具體量按計數(shù)結(jié)果來，大概每個培養(yǎng)基接107個）孢子懸液，并用涂布棒涂布均勻

10、。（無菌操作） 培養(yǎng) 放在恒溫培養(yǎng)箱中30恒溫培養(yǎng)72h（具體時間根據(jù)米曲霉的生長狀態(tài)。最佳形態(tài)1.3.3酶的提取分離和純化1、粗酶液的提取4 在發(fā)酵結(jié)束后，在培養(yǎng)基加蒸餾水100ml，搗碎并攪拌均勻，40水浴浸提1h，用無菌紗布過濾（或抽濾），然后在5000r/min條件下離心20min,取上清液作為粗酶液。2、淀粉酶的初步分離純化（鹽析沉淀法）硫酸銨鹽析 1）發(fā)酵液上清裝至1支燒杯中。 2）加硫酸銨至燒杯中，對照25硫酸銨飽和度配置表，使其飽和度60%。在加硫酸銨時需緩慢的加入，同時不斷的輕柔攪拌（否則局部濃度過高會使酶失活）使硫酸銨完全溶解； 3）室溫靜置2h，出現(xiàn)白色沉淀4）離心，得到

11、沉淀，再用PBS緩沖液沖洗2次，并離心，得到較純的酶。（飽和硫酸銨的配制方法：見附錄一）1.3.4酶活力的測定5 1.3.4.1、麥芽糖標準曲線的制作取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表1加入試劑：試 劑管 號123456麥芽糖標準液（mL）0.10.20.30.40.50.6蒸餾水（mL）0.90.8070.60.50.4在 50水浴中預熱 3min 后，加入 2mL 濃度為 1%的淀粉溶液在 50水浴中反應 5min，立即加入已在沸水浴中預熱的 4mL3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后放入沸水浴中反應10min另取 1 支 25mL 的試管，加入 1mL 蒸餾水，同法操作，作空白實驗。在波長

12、 500nm 處測定溶液的吸光度6，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線1.3.4.2、淀粉酶液的制備吸取上述制備的淀粉酶10mg，放入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶總活力的測定。1.3.4.3、酶活力的測定：實驗采用的方法是：取樣液，用 pH 6.8的磷酸鹽緩沖液稀釋 5 倍。取稀釋后的酶液 1mL，在 50的水浴中預熱 3min，立即加入 2mL 1%的淀粉溶液，在 50的水浴中反應 5min，立即加入已在沸水浴中預熱的 4mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，搖勻后放入沸水浴中反應 10min，在波長 500nm 處分別測定各自的吸光度。根據(jù)標準

13、曲線酶的濃度。本實驗規(guī)定：50時 5min 內(nèi)水解淀粉釋放 1mg 麥芽糖所需的酶量為 1 個酶活力單位(U)。計算酶活力公式為：酶活力單位(U)=C酶V酶n酶式中：C酶酶液中麥芽糖的濃度； V酶提取酶液的總體積； n酶酶液的稀釋倍數(shù)。2. 結(jié)果與分析2.1粗酶液反應后吸光度值吸光度值10.02320.02230.024平均值0.0232.2提純后酶液反應的吸光度值圖中指針所指為提純后的酶吸光度值10.03720.03630.038平均值0.037酶活力單位(U)=C酶V酶n酶=0.165671=1.15922.3固態(tài)發(fā)酵過程固態(tài)培養(yǎng)第一天固態(tài)培養(yǎng)第二天固態(tài)培養(yǎng)第三天2.4結(jié)果分析通過實驗結(jié)果

14、可知在50時 5min 內(nèi)水解淀粉釋放 1mg 麥芽糖所需的酶量為 1 個酶活力單位(U)。其大小為1.1592.此次測得的酶的活力過小。其可能原因如下：（1）當我們培養(yǎng)基培養(yǎng)到第三天時通過照片可以看出，酶還沒有長成熟，仍處于生長階段，所以分泌的淀粉酶可能導致活性不高；（2)在酶提純時所得到的純酶過少，在5min內(nèi)不能發(fā)揮很大的作用;（3)硫酸銨鹽析法時，硫酸銨濃度的控制沒有經(jīng)過很好的探究實驗，只是根據(jù)所查文獻配的，所以可能不是最佳的濃度，所以得到的純酶少。3. 思考題3.1酶活力測定時為什么要保溫 5min？答;50為淀粉酶反應的最適溫度，保溫五分鐘能夠使酶充分與淀粉發(fā)生反應。使實驗結(jié)果更準確。3.2要使本實驗更精確應如何優(yōu)化？ 答：（1）本次實驗中菌種涂布可以更均勻一點； （2）酶活力測定時準確計時，在時間到達前要做好下一步準備，減少誤差； （3）酶活力測定提前將酶液和淀粉溶液預熱至50度，避免溫度變化的影響 （4）本次實驗未測含水率，下次要考慮實驗室條件，及時對實驗方案做出調(diào)整。 （5）提前做好硫酸銨鹽析法最適濃度的測定實驗，使提純達到更好的純度。 （6）固態(tài)培養(yǎng)時嚴格要求：待其顏色由白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色，背面無色時，表明發(fā)酵完成。然后再制作孢子懸液。4. 參考文獻1 賀勝英, 王玉雙, 楊云娟等