建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草苷的方法

1、圭立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的方法建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的方法本文關(guān)鍵詞: 測(cè)定，成分，建立，方法，木犀建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的方法本文簡(jiǎn)介: 摘要：目的:建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的方法, 并分析不同生長(zhǎng)過程杭菊葉中綠原酸類和黃酮類成分的動(dòng)態(tài)變化，比較同期采收 的杭菊葉與杭菊花中成分的差異，為杭菊葉的質(zhì)量控制、合理利用提供參考。方 法：采摘不同生長(zhǎng)時(shí)期的杭菊葉樣品及盛花期的杭菊花樣品，采用HPLC方法對(duì) 杭菊葉及杭菊花建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的方

2、法本文內(nèi)容:摘要：目的：建立HPLC同時(shí)測(cè)定杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的方 法，并分析不同生長(zhǎng)過程杭菊葉中綠原酸類和黃酮類成分的動(dòng)態(tài)變化，比較同期 采收的杭菊葉與杭菊花中成分的差異，為杭菊葉的質(zhì)量控制、合理利用提供參考。 方法：采摘不同生長(zhǎng)時(shí)期的杭菊葉樣品及盛花期的杭菊花樣品，采用HPLC方法 對(duì)杭菊葉及杭菊花中綠原酸類及黃酮類成分進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：不同生長(zhǎng)時(shí)期杭菊 葉中綠原酸類及木犀草昔成分呈不同的規(guī)律。新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B 隨著生長(zhǎng)時(shí)間而逐漸累積，到9月含量達(dá)到峰值后逐步下降；綠原酸、異綠原酸 A則隨著成分累積，在9月達(dá)到峰值，下降后又在11月出現(xiàn)次峰值。木犀草昔則隨著生長(zhǎng)

3、過程逐步増加，到11月達(dá)到含量峰值。同期采收的杭菊葉中綠原酸 類及黃酮類成分高于杭菊花。結(jié)論：該研究結(jié)果為確定杭菊葉的采收時(shí)間及質(zhì)量 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)提供了參考和依據(jù)，為揭示杭菊葉生長(zhǎng)過程中資源性化學(xué)成分的變化以 及藥材品質(zhì)的控制奠定了一定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：杭菊葉；綠原酸；黃酮；生長(zhǎng)過程；動(dòng)態(tài)變化；杭白菊又稱杭菊，是菊科植物Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀 花序，具有散風(fēng)清熱，平肝明目、清熱解毒功效1,是著名的浙江道地藥材浙 八味之一。杭菊在采收的同時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的莖、葉，并且產(chǎn)量比菊花大的多, 這些莖、葉往往被視作副產(chǎn)品丟棄，而菊葉具有清肝明目、解毒消腫等功效，可

4、用于頭風(fēng)、目眩、疔瘡、癰腫等證2,具有一定的藥用價(jià)值。杭菊葉中尚含有大 量有機(jī)酸、黃酮等成分，其中綠原酸類成分含量較高，包括單咖啡?；鼘幩? 綠原酸（3-0-咖啡?；鼘幩幔?、新綠原酸（5-0-咖啡?；鼘幩幔㈦[綠原酸 （4-0-咖啡?；鼘幩幔?，二咖啡?；鼘幩幔寒惥G原酸A （3,5-0-二咖啡?；?奎寧酸）、異綠原酸B （3,4-0-二咖啡酰基奎寧酸）、異綠原酸C （4, 5-0-二咖 啡?；鼘幩幔?，具有抗誘變、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗氧化、降血壓血 脂等多種生物活性3, 4.杭菊為浙江道地藥材，主產(chǎn)于桐鄉(xiāng)等地，杭菊葉資源豐富，為了合理開發(fā)和 綜合利用杭菊葉，本文建立了 HPLC

5、同時(shí)測(cè)定菊葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原 酸、異綠原酸A、異綠原酸B、木犀草昔的方法；分析了杭菊葉不同生長(zhǎng)過程中 綠原酸類成分與木犀草昔的變化趨勢(shì)；并比較了同期采收的杭菊葉與杭菊花中綠 原酸類成分與木犀草昔的含量差異，以期為確定杭菊葉的采收時(shí)間、質(zhì)量控制、 資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料1.1儀器Thermo U3000型高效液相色譜儀，1/10萬電子天平(Sartorius R200D)； B3200S-T超聲機(jī)(必能信超聲有限公司)；Simplicity純水儀(美國密理博 公司)1.2試藥新綠原酸(15012821)、綠原酸(14111207)、隱綠原酸(15020603)、異 綠原酸A

6、(13041309)、異綠原酸B (15042210)、木犀草昔(13100904)購自 成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，其純度均98%.甲醇(色譜純140405)購于天津四友，水為超純水(自制),甲醇、磷酸均 為分析純。杭菊葉及杭菊花樣品采自金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院百草園，經(jīng)金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī) 學(xué)院羅國海副教授鑒定為菊科植物Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭 狀花序和葉。采收后的杭菊葉采用自然干燥方法干燥，杭菊花采用蒸曬方式進(jìn)行 干燥。2方法與結(jié)果2. 1色譜條件色譜柱為 Thermo Syncronis C18 柱(4. 6 mm 250 mm, 5 m)；流動(dòng)相：A

7、 相 為甲醇,B相為體積分?jǐn)?shù)0. 1%磷酸水，梯度洗脫程序詳見表1.流速為1 ml min-1; 波長(zhǎng)為325 nm;柱溫為30 °C ；進(jìn)樣量為5 L.2. 2溶液制備對(duì)照品溶液的配制分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、木犀草昔對(duì) 照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每lmL含新綠原酸0.102 mg、綠原酸0. 166 mg、隱綠原酸0. 010 mg、異綠原酸A 0. 063 mg、異綠原酸B 0. 0405 mg、木犀草n 0.0632 mg的溶液，即得。2. 2. 2供試品溶液的制備取杭菊葉及杭菊花(于2021年11月21號(hào)采摘，下同)干

8、燥粉末(過40目 篩)各0.20g,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇20 mL,稱定重量，超聲處理30 min (300 W, 45 Hz),放冷，再稱定重量，用70% 甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。對(duì)照品和供試品的色譜圖見圖1, 2和圖3.2. 3方法學(xué)考察2. 3. 1線性關(guān)系考察精密吸取各對(duì)照品溶液1,3,5,7,10 L注入高效液相色譜儀，按上述色譜條 件測(cè)定峰面積，以各對(duì)照品進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表2.2. 3. 2精密度試驗(yàn)精密吸取杭菊葉樣品(20211121)供試品溶液

9、5 L,按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn) 樣5次，分別測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木 犀草昔的峰面積，結(jié)果6種成分峰面積的RSD分別為0. 37%.0. 40%.0. 28%.0. 74%. 0. 32%和0. 54%,表明精密度良好。2. 3. 3重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的杭菊葉樣品(20211121) 5份，按項(xiàng)下供試品溶液的制 備方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 L,注入色譜儀，按2. 1項(xiàng)下色譜條件 記錄色譜圖，測(cè)定6種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異 綠原酸B、異綠原酸A、木犀草昔平均含量分別為0. 70%、1. 57%、0. 15%、0. 28%、

10、 3. 10% 和 0. 50%, RSD 分別為 1.04%、0.83%、1.48%、1.66%、1.27% 和 1. 53%,表 明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。2. 3.4穩(wěn)定性試驗(yàn)分別在0,2,4, 8,12, 24 h精密吸取同一供試品(20211121)溶液5 L,注入液 相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定峰面積，結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠 原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木犀草昔峰面積的RSD分別為0.75%、0.86%、 0.43%、0.98%、0. 77%和0. 41%,表明6種成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。加樣回收率取已知6種成分含量的樣品粉末五份，分別精密加入一定量的對(duì)照品溶液， 按

11、項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定6種成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果 新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、木犀草昔的回收率分 別為，100. 7%、99. 1%、99. 7%、101. 2%、100. 8%和 99. 8%, RSD 分別為 2. 4%、1. 6%、 2.8%、2.0%、1.6%和 1.8%.2.4杭菊葉生長(zhǎng)過程中5種綠原酸成分及總綠原酸動(dòng)態(tài)變化按2. 2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和色譜條件對(duì)所收集的不同生長(zhǎng)時(shí)期 的杭菊葉樣品中的綠原酸類成分進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表4、圖4、圖3.對(duì)4月至11月杭菊葉整個(gè)生長(zhǎng)過程中采收的杭菊葉樣品中5種綠原酸類成分 進(jìn)行了測(cè)定，新

12、綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B和異綠原酸A含量范圍 分別為 0.13%、1. 33%2. 84%、0. 04%0. 20%、0. 12虻0. 40%和 2. 75虻3. 89%,平均含量為0.70%. 1. 80%. 0.12%、0.24%和3. 29%. 5種綠原酸類成分含量由高 到低依次為異綠原酸A、綠原酸、新綠原酸、異綠原酸B、隱綠原酸。杭菊葉中的新綠原酸、隱綠原酸和異綠原酸B均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)， 且均以9月份采收為最高；而綠原酸和異綠原酸A則以4月份植物初長(zhǎng)葉時(shí)含量 最高，其后5月份劇烈下降，再平穩(wěn)、緩慢上升，至11月份達(dá)到次高值。而綠 原酸類總成分含量亦呈現(xiàn)初始較高、降低

13、后升高、再降低的趨勢(shì)，以4月份采收 的杭菊葉中綠原酸類成分總含量最高，達(dá)7. 48%;9月份次之，達(dá)6. 65%.2.5杭菊葉生長(zhǎng)過程中木犀草昔動(dòng)態(tài)變化按2. 2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和色譜條件對(duì)所收集的不同生長(zhǎng)時(shí)期 的杭菊葉樣品中的木犀草昔含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖6.木犀草昔以4月份植物初長(zhǎng)葉時(shí)含量較高，5月后含量下降.然后慢慢増加, 至11月份含量最高。2.6同期采收的杭菊葉與花綠原酸類成分及木犀草昔的比較按項(xiàng)下供試品溶液的制備方法和色譜條件對(duì)11月同期采收的杭菊葉 和杭菊花樣品進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表5、圖7.結(jié)果顯示，在同期采收的杭菊葉與杭菊花綠原酸類成分中，隱綠原酸與異綠 原

14、酸B相近，而新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A含量杭菊葉則比杭菊花高出約 3、6倍。黃酮類成分中，杭菊葉的木犀草昔含量也較杭菊花高出3倍左右。3討論本實(shí)驗(yàn)對(duì)杭菊葉中5種綠原酸類成分及木犀草昔的測(cè)定方法進(jìn)行了研究，實(shí) 驗(yàn)所確定的方法可以一次性同時(shí)測(cè)定6種成分，且簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確.有效地揭示了不 同生長(zhǎng)時(shí)期杭菊葉中綠原酸類成分及黃酮類成分的動(dòng)態(tài)變化,可用于杭菊葉的質(zhì) 量控制。綠原酸類成分是咖啡酸與奎寧酸形成的脂類，其分子結(jié)構(gòu)中含有酯鍵、不飽 和雙鍵、多元酚等不穩(wěn)定部分，在提取過程中，易通過水解和分子內(nèi)酯基的遷移 而發(fā)生異構(gòu)化5-7,因此在提取時(shí)避免采用加熱回流的方法8,而采取了超聲 提取的方法，減少溫度對(duì)其成

15、分的影響。通過對(duì)不同溶劑的比較（甲醇、70%甲 醇、50%甲醇、30%甲醇）、超聲時(shí)間、溶劑體積等進(jìn)行比較，確定供試品制備方 法為0. 20g樣品加70%甲醇超聲提取30min即可，操作簡(jiǎn)便。綠原酸是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合 物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸類成分的抗氧化活性隨著咖啡酰基的増加而増加9, 而當(dāng)咖啡?；娜〈鷶?shù)減少時(shí)，其抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基的活性隨之減少 10.本研究結(jié)果顯示，杭菊葉中綠原酸類成分總含量除新葉生長(zhǎng)期4月份外， 以9月份采收最高，達(dá)6. 65%,這可能與9月上、中旬是菊花現(xiàn)蕾期，菊花在這 時(shí)進(jìn)入生長(zhǎng)盛期及生殖生長(zhǎng)期，有氧呼吸増強(qiáng)有關(guān)。杭菊花

16、含有多種成分11-12，其中黃酮、揮發(fā)油被認(rèn)為是杭菊花的有效成 分，杭菊花中的酚性成分被認(rèn)為與其心血管作用密切相關(guān)131.2021年版中國 藥典以綠原酸和木犀草昔作為菊花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定的指標(biāo)成分1.杭菊花 的采收旺季是每年的11月份，采收過后大量的杭菊葉將作為廢棄品除去，而本 文研究結(jié)果顯示，同期采收的杭菊葉中綠原酸類總成分含量及木犀草昔含量高于 杭菊花，這與陳偉等14的測(cè)定結(jié)果一致。且此時(shí)也是杭菊葉生長(zhǎng)過程中木犀草 昔含量最高的時(shí)節(jié)，綠原酸和異綠原酸A含量也較高，因此，每年11月份杭菊 花采收完畢后，原本作為副產(chǎn)品被棄去莖、葉類資源完全可以作為提取木犀草昔 及綠原酸類成分的原材料，使資源

17、得以綜合利用。參考文獻(xiàn)1 Ch.P （中國藥典）Part 1 S. 2021:310.2J Editorial board of the second edition of Nanjing University Of Chinese Medicine Great Dictionary of traditional Chinese Medicine （中 藥大辭典）M Second edition （2） o Shanghai: Shanghai Scientific Technical Publishers. 2021:2901.3 Gao JM, Zhang AL, Zhang KJ, et

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