在石蠟切片中進行微切割-PCR-銀染的方法

1、在石蠟切片中進行微切割-PCR-銀染的方法【摘要】目的探索在石蠟切片中應用微切割-PCR-銀染技術，檢測大腸癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和雜合性缺失。方法用微切割技術在28例石蠟切片中提取淋巴細胞和間質(zhì)細胞、癌旁粘膜腺管、不典型增生腺管、腺瘤腺管和腺癌細胞，每例至少包含3種類型細胞，經(jīng)蛋白酶K消化后，直接用于PCR擴增，產(chǎn)物進行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染。共進行了TGF-R(A)10、hMSH2(A)26-Bat26，hMSH3(A)8，hMSH6(C)8 4個微衛(wèi)星位點的檢測。結果hMSH3(A)8和hMSH6(C)8位點在28例標本全部擴增出目的片段，而TGF-R(A)10和hMSH2(A)2

2、6位點則分別有23例、22例擴增出目的片段，且hMSH2(A)26位點有5例癌細胞呈陽性，其中1例同時有腺瘤細胞陽性。結論微切割-PCR-銀染技術應用于石蠟切片，可獲得較滿意的結果，可用于檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等研究?！娟P鍵詞】微切割；聚合酶鏈反應；銀染；石蠟切片；大腸癌；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 Methods for microdissection-PCR-silver stain technique in paraffin-embedded tissue sectionsHUANG Zhida, HUANG Qiong, LAI Maode【Abstract】ObjectiveTo use the m

3、icrodissection-PCR-silver stain technique in the paraffin-embedded tissue sections and analyze the microsatellite instability in colorectal cancer. MethodsBy microdissection technique, the lymphocytes and mesenchymal cells, normal mucous epithelial cells, displasia, adenoma, and carcinoma cells were

4、 recovered from paraffin-embedded tissue sections. The cells were digested by protinase K;the cell lysates were used as PCR template and the PCR products were analysed by denatured polyacrylamide gel electrophoresis and silver stain. Four microsatellite loci, TGF- R(A)10, hMSH2(A)26-Bat-26, hMSH3(A)

5、8, hMSH6(C)8,were analyzed. ResultsIn all 28 specimens, hMSH3(A)8 and hMSH6(C)8 loci were amplified successfully.TGF-R(A)10, Bat-26 had consistent amplification in 23/28, 22/28 specimens, respectively. And Bat-26 microsatellite instability was found in carcinoma cells in 5 specimens, and in adenoma

6、cells in one of the 5 specimens. Conclusion Microdissection-PCR-silver stain technique can be used in paraffin-embedded tissue sections with satisfactory results. This method can be employed in analyzing microsatellite instability in colorectal carcinoma. 【Key words】microdissection;polymerase chain

7、reaction;silver stain;paraffin-embedded section;colorectal cancer;microsatellite instability*Project No.39770297, supported by the National Natural Science Foundation of China微切割-PCR技術是在顯微鏡下精確提取單一類型細胞進行PCR的方法。近年來，微切割-PCR技術在腫瘤發(fā)病機理研究中的應用已越來越多。它對判斷某基因是否存在雜合性或純合性缺失、以及基因突變發(fā)生于腫瘤進程中的特定階段等，都有重要的應用價值。國外已報道多種

8、微切割-PCR技術，主要應用于冰凍切片中，現(xiàn)已成功地在石蠟切片中得以應用。鄧飛等1在淋巴瘤冰凍切片中提取單個細胞進行PCR，擴增成功率為31.6%，而在石蠟切片中提取細胞數(shù)多至37個仍未能擴增出特異性產(chǎn)物。國內(nèi)尚未見在大腸癌的石蠟切片中進行微切割-PCR的報道。我們在大腸癌的石蠟切片中進行了微切割-PCR-銀染技術的探索，以便用于檢測微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等的研究。1材料和方法1.1材料表14對引物序列及PCR產(chǎn)物Table 1Primer sequences and PCR productsLocus(位點)Primer sequence(引物序列)Product(產(chǎn)物)Bat-265-TGACTA

9、CTTTTGACTTCAGCC-3121 bp含(A)265-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3TGF-R5-AAGCTCCCCTACCATGACT-3118 bp含(A)105-TGCACTCATCAGAGCTACAG-3hMSH35-AGATGTGAATCCCCTAATCAAGC-3153 bp含(A)85-ACTCCCACAATGCCAATAAAAAT-3hMSH65-GGGTGATGGTCCTATGTGTC-394 bp含(C)85-CGTAATGCAAGGATGGCGT-31.2方法1.2.1石蠟切片預處理脫蠟、水化、染色：10 m石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次，各15 mi

10、n；100%、95%、75%、50%乙醇水化各5 min；蒸餾水5 min，兩次；0.08%甲苯胺藍染色30 s。洗滌后置蒸餾水中待用2。1.2.2微切割用玻璃微電極在酒精燈下自制成微切割工具。在切片上滴加少許滅菌雙蒸水，Olympus光學顯微鏡，10倍物鏡下進行微切割?？煞謩e提取淋巴細胞、間質(zhì)細胞、癌旁粘膜腺管、腺瘤腺管、不典型增生腺管及癌細胞，每例至少包含3種類型細胞(1，2)。 1腫瘤組織微切割前Fig 1Tumor tissue section before microdissection2腫瘤組織微切割后Fig 2Tumor tissue section after microdis

11、section1.2.3提取細胞的消化提取的細胞約30004000個置50 l消化液(TET：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，2 mmol/L EDTA pH8.0，0.5%Tween-20，0.5 mg/ml蛋白酶K)，55 3 h，95 10 min滅活蛋白酶K。此細胞消化液即可用作PCR擴增模板。1.2.4PCR體系、參數(shù)總體積為25 l，含10緩沖液(Promega)2.5 l，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.5 l(終濃度200 mol/L)，MgCl2 1.8 l(25 mmol/L，終濃度為1.8 mmol/L)，引物各0.3 l(終濃度150 nm

12、ol/L)，Taq酶(Promega)0.1 l(0.5 U)，模板2 l；95 4 min，95 30 s，53 30 s，72 30 s 45(或50)個循環(huán)，72 5 min(Eppendorf梯度PCR儀)。1.2.5對照TET消化液作空白對照，新鮮大腸癌組織抽提DNA作陽性對照。1.3結果觀察1.3.1電泳8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(7 mol/L尿素)：800V 1.5 h 7.5 l PCR產(chǎn)物+7.5 l變性緩沖液(98%甲酰胺，2% EDTA 0.5 mol/L pH8.0，0.025%溴酚藍)95 5 min，冰水驟冷，上樣。1.3.2銀染3試劑：10%乙醇、1%硝酸、0.

13、012 mol/L硝酸銀、0.28 mol/L碳酸鈉(含0.65甲醛)、10%乙酸；步驟：10%乙醇5 min，蒸餾水漂洗1 min；1%硝酸3 min，蒸餾水漂洗1 min；0.012 mol/L AgNO3 10 min，蒸餾水漂洗2030 s；0.28 mol/L Na2CO3(含甲醛)約56 min；10%乙酸3 min，蒸餾水洗滌。制成干膠。2結果hMSH3、hMSH6位點所有病例均見特異產(chǎn)物條帶(3)。3hMSH3(A)8位點PCR產(chǎn)物電泳1：淋巴細胞，間質(zhì)細胞；2：癌旁正常粘膜腺管；3：癌細胞；4：陽性對照；5：空白管Fig 3Electrophoresis band of lo

14、cus hMSH3(A)8 PCR productsLane 1：lymphocytes,mesenchymal cells;lane 2：normal appearance glands adjacent to cancer; lane 3:cancerous cells; 4:positive control; lane 5:blankTGR-R位點23例見特異產(chǎn)物條帶，5例擴增效果不佳，擴增不穩(wěn)定，其中1996年3例(3/10)、1998年2例(2/18)。Bat-26位點22例見特異條帶，6例擴增效果不佳，擴增不穩(wěn)定，其中1996年4例(4/10)，1998年2例(2/18)。其中5例

15、在癌細胞中有電泳條帶的改變，有1例同時在腺瘤細胞中有電泳條帶改變(4)。4Bat-26位點PCR產(chǎn)物電泳1：淋巴細胞，間質(zhì)細胞；2：癌旁正常粘膜腺管；3：腺瘤細胞；4：癌細胞；5：空白管Fig 4Electrophoresis bands of locus Bat-26Lane 1:lymphocytes, mesenchymal cells;lane 2:normal appearance glands adjacent to cancer;lane 3: adenoma cells; lane 4: cancerous cells; lane 5:blank3討論國外微切割-PCR技術主要

16、應用于冰凍切片，現(xiàn)已成功地在石蠟切片中得以應用，近年已廣泛應用于各種實體瘤的研究，微切割技術也從簡單的機械操作發(fā)展成以先進的激光捕獲技術為主。由于石蠟切片制作過程中可造成DNA損傷等因素，導致石蠟切片微切割-PCR有一定難度，國內(nèi)尚未見在石蠟切片中進行微切割-PCR較成功的報道。在實驗中我們有以下幾點體會。3.1微切割細胞數(shù)量50 l消化液中經(jīng)微切割提取的細胞數(shù)量最好在30004000以上。這樣，每個PCR反應管可含120160以上細胞的DNA量，PCR擴增效果較好。鄧飛等在淋巴瘤石蠟切片中提取537個細胞/PCR反應管，均不能擴增出特異性產(chǎn)物。說明石蠟切片中提取細胞進行PCR，必須有足夠的細胞量。3.2PCR擴增有兩點值得注意：(1)要有合適的引物濃度：引物濃度不能太高，否則極易形成引物二聚體，嚴重影響模板的擴增效率；太低亦影響擴增效率。(2)理想的循環(huán)數(shù)；4550個PCR循環(huán)擴增效率較好，少至35個循環(huán)極易出現(xiàn)擴增效率不均一。3.3銀染銀染是較好的觀察結果方法，其靈敏度比EB染色高。銀染對環(huán)境溫度較為敏感，應根據(jù)不同環(huán)境溫度調(diào)整AgNO3、Na2CO3的作用時間。在冬天，AgNO3可作用15 min，Na2CO3作用時間可延長1倍至12 min左右。如不延長Na2CO3作用時間則易導致銀染失敗的結論。3.4微切割在普通光學顯微鏡下進行是可行的，不必購置貴重的儀器，但對操作者