在石蠟切片中進(jìn)行微切割-PCR-銀染的方法

1、在石蠟切片中進(jìn)行微切割-PCR-銀染的方法【摘要】目的探索在石蠟切片中應(yīng)用微切割-PCR-銀染技術(shù)，檢測(cè)大腸癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和雜合性缺失。方法用微切割技術(shù)在28例石蠟切片中提取淋巴細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞、癌旁粘膜腺管、不典型增生腺管、腺瘤腺管和腺癌細(xì)胞，每例至少包含3種類型細(xì)胞，經(jīng)蛋白酶K消化后，直接用于PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染。共進(jìn)行了TGF-R(A)10、hMSH2(A)26-Bat26，hMSH3(A)8，hMSH6(C)8 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的檢測(cè)。結(jié)果hMSH3(A)8和hMSH6(C)8位點(diǎn)在28例標(biāo)本全部擴(kuò)增出目的片段，而TGF-R(A)10和hMSH2(A)2

2、6位點(diǎn)則分別有23例、22例擴(kuò)增出目的片段，且hMSH2(A)26位點(diǎn)有5例癌細(xì)胞呈陽(yáng)性，其中1例同時(shí)有腺瘤細(xì)胞陽(yáng)性。結(jié)論微切割-PCR-銀染技術(shù)應(yīng)用于石蠟切片，可獲得較滿意的結(jié)果，可用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等研究?！娟P(guān)鍵詞】微切割；聚合酶鏈反應(yīng)；銀染；石蠟切片；大腸癌；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 Methods for microdissection-PCR-silver stain technique in paraffin-embedded tissue sectionsHUANG Zhida, HUANG Qiong, LAI Maode【Abstract】ObjectiveTo use the m

3、icrodissection-PCR-silver stain technique in the paraffin-embedded tissue sections and analyze the microsatellite instability in colorectal cancer. MethodsBy microdissection technique, the lymphocytes and mesenchymal cells, normal mucous epithelial cells, displasia, adenoma, and carcinoma cells were

4、 recovered from paraffin-embedded tissue sections. The cells were digested by protinase K;the cell lysates were used as PCR template and the PCR products were analysed by denatured polyacrylamide gel electrophoresis and silver stain. Four microsatellite loci, TGF- R(A)10, hMSH2(A)26-Bat-26, hMSH3(A)

5、8, hMSH6(C)8,were analyzed. ResultsIn all 28 specimens, hMSH3(A)8 and hMSH6(C)8 loci were amplified successfully.TGF-R(A)10, Bat-26 had consistent amplification in 23/28, 22/28 specimens, respectively. And Bat-26 microsatellite instability was found in carcinoma cells in 5 specimens, and in adenoma

6、cells in one of the 5 specimens. Conclusion Microdissection-PCR-silver stain technique can be used in paraffin-embedded tissue sections with satisfactory results. This method can be employed in analyzing microsatellite instability in colorectal carcinoma. 【Key words】microdissection;polymerase chain

7、reaction;silver stain;paraffin-embedded section;colorectal cancer;microsatellite instability*Project No.39770297, supported by the National Natural Science Foundation of China微切割-PCR技術(shù)是在顯微鏡下精確提取單一類型細(xì)胞進(jìn)行PCR的方法。近年來(lái)，微切割-PCR技術(shù)在腫瘤發(fā)病機(jī)理研究中的應(yīng)用已越來(lái)越多。它對(duì)判斷某基因是否存在雜合性或純合性缺失、以及基因突變發(fā)生于腫瘤進(jìn)程中的特定階段等，都有重要的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)外已報(bào)道多種

8、微切割-PCR技術(shù)，主要應(yīng)用于冰凍切片中，現(xiàn)已成功地在石蠟切片中得以應(yīng)用。鄧飛等1在淋巴瘤冰凍切片中提取單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行PCR，擴(kuò)增成功率為31.6%，而在石蠟切片中提取細(xì)胞數(shù)多至37個(gè)仍未能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)在大腸癌的石蠟切片中進(jìn)行微切割-PCR的報(bào)道。我們?cè)诖竽c癌的石蠟切片中進(jìn)行了微切割-PCR-銀染技術(shù)的探索，以便用于檢測(cè)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等的研究。1材料和方法1.1材料表14對(duì)引物序列及PCR產(chǎn)物Table 1Primer sequences and PCR productsLocus(位點(diǎn))Primer sequence(引物序列)Product(產(chǎn)物)Bat-265-TGACTA

9、CTTTTGACTTCAGCC-3121 bp含(A)265-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3TGF-R5-AAGCTCCCCTACCATGACT-3118 bp含(A)105-TGCACTCATCAGAGCTACAG-3hMSH35-AGATGTGAATCCCCTAATCAAGC-3153 bp含(A)85-ACTCCCACAATGCCAATAAAAAT-3hMSH65-GGGTGATGGTCCTATGTGTC-394 bp含(C)85-CGTAATGCAAGGATGGCGT-31.2方法1.2.1石蠟切片預(yù)處理脫蠟、水化、染色：10 m石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟兩次，各15 mi

10、n；100%、95%、75%、50%乙醇水化各5 min；蒸餾水5 min，兩次；0.08%甲苯胺藍(lán)染色30 s。洗滌后置蒸餾水中待用2。1.2.2微切割用玻璃微電極在酒精燈下自制成微切割工具。在切片上滴加少許滅菌雙蒸水，Olympus光學(xué)顯微鏡，10倍物鏡下進(jìn)行微切割。可分別提取淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、癌旁粘膜腺管、腺瘤腺管、不典型增生腺管及癌細(xì)胞，每例至少包含3種類型細(xì)胞(1，2)。 1腫瘤組織微切割前Fig 1Tumor tissue section before microdissection2腫瘤組織微切割后Fig 2Tumor tissue section after microdis

11、section1.2.3提取細(xì)胞的消化提取的細(xì)胞約30004000個(gè)置50 l消化液(TET：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，2 mmol/L EDTA pH8.0，0.5%Tween-20，0.5 mg/ml蛋白酶K)，55 3 h，95 10 min滅活蛋白酶K。此細(xì)胞消化液即可用作PCR擴(kuò)增模板。1.2.4PCR體系、參數(shù)總體積為25 l，含10緩沖液(Promega)2.5 l，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.5 l(終濃度200 mol/L)，MgCl2 1.8 l(25 mmol/L，終濃度為1.8 mmol/L)，引物各0.3 l(終濃度150 nm

12、ol/L)，Taq酶(Promega)0.1 l(0.5 U)，模板2 l；95 4 min，95 30 s，53 30 s，72 30 s 45(或50)個(gè)循環(huán)，72 5 min(Eppendorf梯度PCR儀)。1.2.5對(duì)照TET消化液作空白對(duì)照，新鮮大腸癌組織抽提DNA作陽(yáng)性對(duì)照。1.3結(jié)果觀察1.3.1電泳8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(7 mol/L尿素)：800V 1.5 h 7.5 l PCR產(chǎn)物+7.5 l變性緩沖液(98%甲酰胺，2% EDTA 0.5 mol/L pH8.0，0.025%溴酚藍(lán))95 5 min，冰水驟冷，上樣。1.3.2銀染3試劑：10%乙醇、1%硝酸、0.

13、012 mol/L硝酸銀、0.28 mol/L碳酸鈉(含0.65甲醛)、10%乙酸；步驟：10%乙醇5 min，蒸餾水漂洗1 min；1%硝酸3 min，蒸餾水漂洗1 min；0.012 mol/L AgNO3 10 min，蒸餾水漂洗2030 s；0.28 mol/L Na2CO3(含甲醛)約56 min；10%乙酸3 min，蒸餾水洗滌。制成干膠。2結(jié)果hMSH3、hMSH6位點(diǎn)所有病例均見(jiàn)特異產(chǎn)物條帶(3)。3hMSH3(A)8位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳1：淋巴細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞；2：癌旁正常粘膜腺管；3：癌細(xì)胞；4：陽(yáng)性對(duì)照；5：空白管Fig 3Electrophoresis band of lo

14、cus hMSH3(A)8 PCR productsLane 1：lymphocytes,mesenchymal cells;lane 2：normal appearance glands adjacent to cancer; lane 3:cancerous cells; 4:positive control; lane 5:blankTGR-R位點(diǎn)23例見(jiàn)特異產(chǎn)物條帶，5例擴(kuò)增效果不佳，擴(kuò)增不穩(wěn)定，其中1996年3例(3/10)、1998年2例(2/18)。Bat-26位點(diǎn)22例見(jiàn)特異條帶，6例擴(kuò)增效果不佳，擴(kuò)增不穩(wěn)定，其中1996年4例(4/10)，1998年2例(2/18)。其中5例

15、在癌細(xì)胞中有電泳條帶的改變，有1例同時(shí)在腺瘤細(xì)胞中有電泳條帶改變(4)。4Bat-26位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳1：淋巴細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞；2：癌旁正常粘膜腺管；3：腺瘤細(xì)胞；4：癌細(xì)胞；5：空白管Fig 4Electrophoresis bands of locus Bat-26Lane 1:lymphocytes, mesenchymal cells;lane 2:normal appearance glands adjacent to cancer;lane 3: adenoma cells; lane 4: cancerous cells; lane 5:blank3討論國(guó)外微切割-PCR技術(shù)主要

16、應(yīng)用于冰凍切片，現(xiàn)已成功地在石蠟切片中得以應(yīng)用，近年已廣泛應(yīng)用于各種實(shí)體瘤的研究，微切割技術(shù)也從簡(jiǎn)單的機(jī)械操作發(fā)展成以先進(jìn)的激光捕獲技術(shù)為主。由于石蠟切片制作過(guò)程中可造成DNA損傷等因素，導(dǎo)致石蠟切片微切割-PCR有一定難度，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)在石蠟切片中進(jìn)行微切割-PCR較成功的報(bào)道。在實(shí)驗(yàn)中我們有以下幾點(diǎn)體會(huì)。3.1微切割細(xì)胞數(shù)量50 l消化液中經(jīng)微切割提取的細(xì)胞數(shù)量最好在30004000以上。這樣，每個(gè)PCR反應(yīng)管可含120160以上細(xì)胞的DNA量，PCR擴(kuò)增效果較好。鄧飛等在淋巴瘤石蠟切片中提取537個(gè)細(xì)胞/PCR反應(yīng)管，均不能擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物。說(shuō)明石蠟切片中提取細(xì)胞進(jìn)行PCR，必須有足夠的細(xì)胞量。3.2PCR擴(kuò)增有兩點(diǎn)值得注意：(1)要有合適的引物濃度：引物濃度不能太高，否則極易形成引物二聚體，嚴(yán)重影響模板的擴(kuò)增效率；太低亦影響擴(kuò)增效率。(2)理想的循環(huán)數(shù)；4550個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增效率較好，少至35個(gè)循環(huán)極易出現(xiàn)擴(kuò)增效率不均一。3.3銀染銀染是較好的觀察結(jié)果方法，其靈敏度比EB染色高。銀染對(duì)環(huán)境溫度較為敏感，應(yīng)根據(jù)不同環(huán)境溫度調(diào)整AgNO3、Na2CO3的作用時(shí)間。在冬天，AgNO3可作用15 min，Na2CO3作用時(shí)間可延長(zhǎng)1倍至12 min左右。如不延長(zhǎng)Na2CO3作用時(shí)間則易導(dǎo)致銀染失敗的結(jié)論。3.4微切割在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行是可行的，不必購(gòu)置貴重的儀器，但對(duì)操作者