分光光度法-生化實驗(共6頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上常用生化實驗技術(shù)：分光光度法 有色溶液對光線有選擇性的吸收作用，不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，對不同波長光線的吸收能力也不同，因此，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜。有些無色溶液，雖對可見光無吸收作用，但所含物質(zhì)可以吸收特定波長的紫外線或紅外線。分光光度法主要是指利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒定物質(zhì)性質(zhì)及含量的技術(shù)，其理論依據(jù)是Lambert和Beer定律。分光光度法是比色法的發(fā)展。比色法只限于在可見光區(qū)，分光光度法則可以擴展到紫外光區(qū)和紅外光區(qū)。比色法用的單色光通過濾光片產(chǎn)生，譜帶寬度為40120nm，精度不高，而分光光度法則要求近于真正單色光，其光譜帶寬最大不超過35nm

2、，在紫外光區(qū)可到l nm以下。單色光通過棱鏡或產(chǎn)生，具有較高的精度。一、光的基本知識光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續(xù)的微粒性和連續(xù)的波動性。波長和頻率是光的波動性的特征，可用下式表示：C式中為波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長。為頻率，即每秒鐘振動次數(shù)。c為光速，等于299 770±4kms。光屬于電磁波。自然界中存在各種不同波長的電磁波，列成表l-l所示的圖。分光光度法所使用的光譜范圍在200nm10m(1m1 000nm)之間。其中200400nm為紫外光區(qū)，400760nm為可見光區(qū)，76010 000 nm為紅外光區(qū)。二、朗伯一比爾(1ambertBee

3、r)定律朗伯比爾定律是比色分析的基本原理，這個定律是討論有色溶液對單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。此定律是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。1朗伯定律一束單色光通過溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的強度就要減弱：若溶液濃度不變，則溶液的厚度愈大(即光在溶液中所經(jīng)過的途徑愈長)，光的強度減低也愈顯著。設(shè)光線通過溶液前的強度為Io(入射光的強度)，通過液層厚為L溶液后光的強度為It（透過光的強度），則表示透過光的強度是入射光強度的幾分之幾，稱為透光度（transmittance）,用T表示。透光度隨溶液厚度的增加而減少，但實踐證明，透光度和溶液層厚度間并不存在簡單的定量關(guān)系，只

4、有透光度的負對數(shù)(-lgT)才隨著溶液厚度的增加而成正比例增加，即將上述比例寫成等式，得到 式中稱為吸光度(A)(absorbance)，又稱為消光度(E)(degree of extinction)或光密度（D）(optical density)。所以AK1L式中K1為比例系數(shù)，其值取決于入射光的波長，溶液的性質(zhì)和濃度以及溶液的溫度等。上式表明，當溶液的濃度不變時，吸光度與溶液液層的厚度成正比，這就是朗伯定律。表1-1 電磁>區(qū)域>波長>來源>M>常用單位y射線10-1210-1010-30.1nm原子核X射線10-1010-180.110nm內(nèi)層電子遠紫外10

5、-82×10-710200nm中層電子紫外2×10-74×10-7200400nm外層價電子可見4×10-77.6×10-7400760nm外層價電子紅外7.6×10-75×10-50.7650m分子振動與分子轉(zhuǎn)動遠紅外5×10-510-3501 000m分子振動與分子轉(zhuǎn)動微波10-310.1100cm分子轉(zhuǎn)動無線電波110311 000m核磁共振 2比爾定律當一束單色光通過有色溶液后，溶液液層的厚度不變而濃度不同時，溶液度愈大，則透射光的強度愈弱，其定量關(guān)系如下：AK2C式中C為有色物質(zhì)溶液的濃度；K2

6、為比例系數(shù)，其值取決于入射光的波長，溶液的性質(zhì)和液層的厚度，以及溶液的溫度等。上式表明，當溶液液層的厚度不變時，吸光度與溶液的濃度成正比，這就是比爾定律。3朗伯比爾定律如果同時考慮吸收層的厚度和溶液濃度對光吸收的影響，則必須將朗伯定律和比爾定律合并起來，得 KLCAKLC即吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比，這就是朗伯比爾定律。在上式中，若L用厘米表示，C用克升表示，則比例常數(shù)K稱為吸光系數(shù)，其值取決于入射的波長，溶液的性質(zhì)和溫度等，而與光的強度、溶液的濃度及液層的厚度無關(guān)。若L用厘米表示，C用摩爾升表示，則上式中的比例常數(shù)用表示，得到A=LC式中稱為物質(zhì)的摩爾吸光率(molar ab

7、sorptivity)或摩爾吸光系數(shù)(molar absorption，coefficient)，其值相當于L=1cm時，C=1mol/L時，在一定波長下的吸光度，它是物質(zhì)的特性常數(shù)。A=LC=×1×1=不同的物質(zhì)可能會有相同的最大吸收波長，但其摩爾吸光系數(shù)不一定相同。值愈大，說明該物質(zhì)溶液對光吸收愈強烈，則比色測定的靈敏度愈高。三、結(jié)構(gòu)簡介分光光度技術(shù)的應(yīng)用1、測定溶液中物質(zhì)的含量可見或紫外分光光度法都可用于測定溶液中物質(zhì)的含量。這需要測定標準溶液(濃度已知的溶液)和未知液(濃度持測定的溶液)的吸光度，將兩者進行比較。由于所用吸收池的厚度是一樣的，可用下式進行計算。式中C

8、x代表未知液的濃度，Cs代表標準液的濃度，Ax和As分別代表未知液和標準液所測得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式計算得之。也可以先測出不同濃度的標準液的吸光度，繪制標準曲線，在選定的濃度范圍內(nèi)標準曲線應(yīng)該是一條直線，然后測定出未知液的吸光度，即可從標準曲線上查到其相對應(yīng)的濃度。含量測定時所用波長通常要選擇被測物質(zhì)的最大吸收波長，這樣做有兩個好處：靈敏度大，物質(zhì)在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；可以避免其他物質(zhì)的干擾。還可利用摩爾吸光率()求得測定物質(zhì)的濃度，由于物質(zhì)的是已知的，讀取光徑(液層厚度)為l cm時溶液的吸光度(A)，則可以用下式計算溶液中物質(zhì)的濃度(C)：此式常在

9、紫外光吸收法時應(yīng)用，無需顯色反應(yīng)，操作方便。2、用紫外光譜鑒定化合物使用可以繪制吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然后以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制吸光度一波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質(zhì)有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質(zhì)種類的鑒定。當一種未知物質(zhì)的吸收光譜曲線和某一已知物質(zhì)的吸收光譜曲線形狀一樣時，則很可能它們是同一物質(zhì)。一定物質(zhì)在不同濃度時，其吸收光譜曲線中峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低谷的波長是一定不變的。紫外光吸收是由不飽和的結(jié)構(gòu)造成的，含有雙鍵的化合物能表現(xiàn)出吸收峰。

10、紫外光吸收光譜比較簡單，同一種物質(zhì)的紫外光吸收光譜應(yīng)完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結(jié)構(gòu)不一定相同。除了特殊情況外，單獨依靠紫外光吸收光譜不能決定一個未知物的結(jié)構(gòu)，必須與其他方法配合。紫外光吸收光譜分析主要用于己知物質(zhì)的定量分析和純度分析。3、分光光度法的誤差在分光光度法中，即使將各種因素都控制好，對于濃度過大或過小的樣品，誤差仍然很大。因為濃度過大的樣品，其吸光度過高，影響檢測器的靈敏度，且讀數(shù)標尺刻度的精度差，誤差亦大，故難于準確。濃度過低的樣品，其吸光度小，則因與儀器本身因素有關(guān)，也容易引起檢測器標尺上的讀數(shù)誤差。例如光源波動的影響：當光源強度改變1、吸光度為1.0時，只有0.4的

11、誤差，但在吸光度為0.045時，則可產(chǎn)生9.6的誤差。實際上，在整個透光度(或吸光度)范圍的不同部分均有不同的誤差。從理論上推算，相對誤差的最小的部分在透光度為368處(或吸光度為0.4343處)，故通常認為測定值在吸光度0.200.80范圍內(nèi)(透光度為2065)誤差較小，超出此范圍，相對誤差均會增大。影響分光光度法精確度的主要原因還有光譜純度。分光光度計應(yīng)能正確選出光源光譜中所需部分波長作為入射光，一般應(yīng)保持光譜帶寬度在l0 nm以下，如果測定樣品有很狹窄的吸收峰，就必須有更小的光譜寬度，所以分光光度計大多均有可調(diào)的狹縫。在實際使用中，用較大狹縫雖可提高重現(xiàn)性，但由于加大光譜寬度反而降低了準

12、確度。散射光也是引起誤差的重要因素；這里所說的散射光是指一切未經(jīng)過測定溶液吸收，而又落到檢測器上引起干擾的光，如室內(nèi)自然光，經(jīng)過某些漏洞進入儀器而明顯增大了透光度，故高靈敏度的分光光度計宜安裝的光線較暗的室內(nèi)。散射光也包括能透過的非測定需要的其他波長的光，實際上是光譜不純，但因效果與散射光一樣，故也稱為散射光干擾。散射光干擾對高濃度測定特別有害，能使吸光度降低，標準曲線的高濃度部分向下彎曲。4、使用分光光度計的注意事項1分光光度計必須放置在不受振動的儀器臺上，嚴防振動，潮濕和強光直射。2比色杯盛液量以達到杯容積2/3左右為宜。若不慎將溶液流到比色杯的外表面，則必須先用吸干，再用擦鏡紙擦凈。移動比色杯槽要輕，以防溶液濺出，腐蝕機件。3不可用手拿比色