病毒的分離與鑒定.doc

1、病毒的分離與鑒定（一）病毒的分離病毒分離的一般程序是：檢驗(yàn)標(biāo)本 7殺滅雜菌（青、鏈霉素）7接種易感的動(dòng)物出現(xiàn)病狀雞胚7病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)7細(xì)胞病變7鑒定病毒種型（血清學(xué)方法）無菌標(biāo)本（腦脊液、血液、 血漿、血清）可直接接種細(xì)胞、動(dòng)物、雞胚；無菌組織塊經(jīng)培養(yǎng)液洗液洗滌后制成1020%懸液離（一）病毒的分離病毒分離的一般程序是:易感的動(dòng)物7出現(xiàn)病狀檢驗(yàn)標(biāo)本7殺滅雜菌（青、鏈霉素）7接種 雞胚7病變或死亡7鑒定病毒種型（血清學(xué)方法）細(xì)胞培養(yǎng)7細(xì)胞病變無菌標(biāo)本（腦脊液、血液、血漿、血清 ）可直接接種細(xì)胞、動(dòng)物、雞胚；無菌組織塊經(jīng)培 養(yǎng)液洗液洗滌后制成1020%懸液離心后，取上清接種；咽洗液、糞便、尿、

2、感染組織或 昆蟲等污染標(biāo)本在接種前先用抗生素處理，殺死雜菌。1 細(xì)胞培養(yǎng) 用分散的活細(xì)胞培養(yǎng)稱細(xì)胞培養(yǎng) （Cell culture ）。所用培養(yǎng)液是含血清 （通 常為胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、維生素的平衡溶液，PH7.27.4。細(xì)胞培養(yǎng)適于絕大多數(shù)病毒生長，是病毒實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。原代細(xì)胞培養(yǎng)（Primary cell culture）用胰蛋白酶將人胚（或動(dòng)物）組織分散成單細(xì)胞，加一定培養(yǎng)液，37 C孵育1-2天后逐漸在培養(yǎng)瓶底部長成單層細(xì)胞，如人胚腎細(xì)胞、兔腎細(xì) 胞。原代細(xì)胞均為二倍體細(xì)胞，可用于產(chǎn)生病毒疫苗，如兔腎細(xì)胞生產(chǎn)風(fēng)疹疫苗，雞成纖維細(xì)胞產(chǎn)生麻疹疫苗，猴腎細(xì)胞生產(chǎn)脊液灰質(zhì)炎疫苗。因

3、原代細(xì)胞不能持續(xù)傳代培養(yǎng)，故不便用于診斷工作。二倍體細(xì)胞培養(yǎng)（Diploid cell cultune）原代細(xì)胞只能傳2-3代細(xì)胞就退化，在多數(shù)細(xì)胞退化時(shí)，少數(shù)細(xì)胞能繼續(xù)傳下來，且保持染色體數(shù)為二倍體，稱為二倍體細(xì)胞。二倍體細(xì)胞生長迅速，并可傳50代保持二倍體特征，通常是胚胎組織的成纖維細(xì)胞（如 WI-38細(xì)胞系）。二倍體細(xì)胞一經(jīng)建立，應(yīng)盡早將細(xì)胞懸浮于10%二甲基亞砜中，大量分裝安瓿貯存于液氮（-196 C ）內(nèi)，做為 種子”供以后傳代用。目前多用二倍體細(xì)胞系制備病毒疫苗，也用 于病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷工作。傳代細(xì)胞培養(yǎng)（Co ntinous cell culture）通常是由癌細(xì)胞或二倍體細(xì)胞突

4、變而來（如Hela、He p-2、 Vero細(xì)胞系等），染色體數(shù)為非整倍體，細(xì)胞生長迅速，可無限傳代，在 液氮中能長期保存。目前廣泛用于病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷工作，根據(jù)病毒對細(xì)胞的親嗜性，選擇敏感的細(xì)胞系使用。表5.病毒增殖用部分細(xì)胞系及來源細(xì)胞系名稱來源二倍體細(xì)胞系HDCS ,MRC-9 ,WI-38傳代細(xì)胞系人胚肺細(xì)胞，人宮頸癌細(xì)胞，人上皮細(xì)胞，猴腎細(xì)胞，地鼠腎細(xì)胞Hela ,He p-2 ,Vero ,BHK（一）病毒的分離病毒分離的一般程序是：檢驗(yàn)標(biāo)本 T殺滅雜菌（青、鏈霉素）T接種易感的動(dòng)物出現(xiàn)病狀雞胚T病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)T細(xì)胞病變T鑒定病毒種型（血清學(xué)方法）無菌標(biāo)本（腦脊液、血液、血漿、

5、血清）可直接接種細(xì)胞、動(dòng)物、雞胚；無菌組織塊經(jīng)培養(yǎng)液洗液洗滌后制成10 20%懸液離淋巴細(xì)胞培養(yǎng)（Lymphocyte culture ）正常成熟的淋巴細(xì)胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細(xì)胞卻能在體外持續(xù)傳代，這是病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的例證，也是分離出EBV的標(biāo)志。T淋巴細(xì)胞在加入T細(xì)胞生長因子（IL-2 ）后可在體外培養(yǎng)，為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒（ HIV、HTLV）提供了條件，HIV在T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細(xì)胞。2 .動(dòng)物試驗(yàn) 這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根 據(jù)各病毒對組織的親嗜性而定，可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或

6、靜脈，例如嗜神經(jīng)病毒（腦炎病 毒）接種鼠腦內(nèi)，柯薩奇病毒接種乳鼠（一周齡）腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病情況，如有 死亡，則取病變組織剪碎，研磨均勻，制成懸液，繼續(xù)傳代，并作鑒定。3 .雞胚培養(yǎng) 用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動(dòng)物更加經(jīng)濟(jì)簡便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞 胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi)，如有病毒增殖，則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、 尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng)；但很多病毒在雞胚中不生長。（二）分離病毒的鑒定1 .病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征（1）細(xì)胞致病作用（Cytopathogenic effect,CPE）病毒在細(xì)胞內(nèi)

7、增殖引起細(xì)胞退形性變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE,普通光學(xué)倒置顯微鏡下可觀察上述細(xì)胞病變，結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預(yù)測性診斷。免疫熒光（ IF）法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)的 病毒或抗原可被熒光素標(biāo)記的特異性抗體著色，在熒光顯微鏡下可見斑點(diǎn)狀黃綠色熒光，根據(jù)所用抗體的 特異性判斷為何種病毒感染。表6.病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征病毒增殖指征CPE病毒小RNA病毒單純皰疹病毒腺病毒副粘病毒細(xì)胞園縮、單層破壞 細(xì)胞腫大變園 細(xì)胞變園堆積成葡 HIV非CPE病毒正粘病毒副粘病毒風(fēng)疹病毒鼻病萄狀多核巨細(xì)胞（合胞體）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象干擾并阻 毒止其他病毒（如EC

8、HO病毒）的細(xì)胞致病作用（一）病毒的分離病毒分離的一般程序是：檢驗(yàn)標(biāo)本 T殺滅雜菌（青、鏈霉素）T接種易感的動(dòng)物T出現(xiàn)病狀雞胚T病變或死亡細(xì)胞培養(yǎng)T細(xì)胞病變T鑒定病毒種型（血清學(xué)方法）無菌標(biāo)本（腦脊液、血液、 血漿、血清）可直接接種細(xì)胞、動(dòng)物、雞胚；無菌組織塊經(jīng)培養(yǎng)液洗液洗滌后制成1020%懸液離（2）紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象（Hemadsorption phenomenon ） 流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24-48小時(shí),以細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。若加入相應(yīng) 的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)。這一現(xiàn)

9、象不僅可 作為這類病毒增殖的指征，還可作為初步鑒定。（3 ）干擾現(xiàn)象（Interference phenomenon）一種病毒感染細(xì)胞后可以干擾另一種病毒在該細(xì)胞中的增殖，這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒（如風(fēng)疹病毒）但能干擾以后進(jìn)入的病毒（如ECHO 病毒）增殖，使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞不再生產(chǎn)CPE。2.病毒感染性的定量測定空斑形成單位（Plaque-forming unit ,PFU）測定 這是一種測定病毒感染性比較準(zhǔn)確的方法。將適當(dāng)濃度的病毒懸液接種到生長單層細(xì)胞的玻璃平皿或扁瓶中，當(dāng)病毒吸附于細(xì)胞上后，再在其上復(fù)蓋一層溶化 的半固體營養(yǎng)瓊脂層，待凝固后，孵育培養(yǎng)。當(dāng)病毒在細(xì)胞內(nèi)

10、復(fù)制增殖后，每一個(gè)感染性病毒顆粒在單層 細(xì)胞中產(chǎn)生一個(gè)局限性的感染細(xì)胞病灶，病灶逐漸擴(kuò)大，若用中性紅等活性染料著色，在紅色的的背景中 顯出沒有著色的 空斑”清楚可見。由于每個(gè)空斑由單個(gè)病毒顆粒復(fù)制形成，所以病毒懸液的滴度可以用 每毫升空斑形成單位（PFU）來表示。（2） 50%致死量（LD50 ）或50%組織細(xì)胞感染量（TCID50 ）的測定 本法可估計(jì)所含病毒的感染量。 方法是測定病毒感染雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)后，引起 50% 發(fā)生死亡或病變的最小病毒量，即將病毒懸 液作 10倍連續(xù)稀釋，接種于上述雞胚，易感動(dòng)物或組織培養(yǎng)中，經(jīng)一定時(shí)間后，觀察細(xì)胞或雞胚病變，如 絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感動(dòng)物發(fā)病而死亡等，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出50% 感染量或50% 組織細(xì)胞感染量，可獲得比較準(zhǔn)確的病毒感染性滴度。3病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察 病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后，借助磷鎢酸負(fù)染及電子顯微鏡可直接觀察 到病毒顆粒，根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學(xué)技術(shù)分析病毒核酸組成、基因 組織構(gòu)、序列同源性比較加