柱層析和薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、-/柱層析和薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)篇一：柱層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告柱層析分離色素一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 了解柱層析的分類(lèi)，掌握各種柱 層析的原理。2. 熟練掌握吸附層析的原理和操作 技術(shù)。二、【實(shí)驗(yàn)原理】a、葉綠體色素是植物吸收太陽(yáng)光能進(jìn) 行光合作用的重要物質(zhì)，主要有葉綠素 葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。從植物葉片中提取和分離葉綠體色素是對(duì)其認(rèn)識(shí) 和了解的前提。禾o柱層析等。柱 是根據(jù)混合物中各組分對(duì)固定相的吸附能 力，以及對(duì)洗脫劑（即移動(dòng)相）的溶解用葉綠體色素能溶于有機(jī)溶劑的特 ，可用95%乙醇或無(wú)水乙醇提取。 分 離色素的方法有多種，如紙層析、 主層析法是色譜法中的一種，它度不同將各組分分離。常用的柱色譜有吸

2、附色柱譜和 分配柱色譜兩類(lèi)。吸附柱色譜通常是在 玻璃管中填入表面積很大，經(jīng)過(guò)活化的多孔性物質(zhì)或 粉狀固體作為吸附劑（如氧化鋁或硅 膠），當(dāng)混合物的溶液端,脫。流經(jīng)吸附柱時(shí)，就被吸附在柱的上 然后從柱頂加入溶劑（洗脫劑）洗 由于不同化合的吸附能力不同，在物在吸附柱溶劑中的溶解度也不同，因此各組 分隨溶劑以不同速度下移，形成色帶。繼續(xù)用溶劑洗 脫，吸附能力最弱的組分就隨溶劑首先 流出，整個(gè)層析過(guò)程進(jìn)行反復(fù)的吸附-解析-再吸附-再 解吸。用柱層析法可以分別收集各組分， 并逐個(gè)鑒定。本實(shí)驗(yàn)是把三氧化二鋁填 入玻璃管中（壓成柱狀）作為吸附劑， 將葉綠體色素的石油醚,色素即被吸提取液傾于吸附柱附。I于色素

3、的種類(lèi)不同，被吸附的強(qiáng) 弱不同，就在吸附三上排列成為不同的色層，再利用吸附劑在不同溶劑中有不同的吸附力， 用不同的溶劑進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到葉綠體主要的 色素（葉綠素a、葉綠素b、葉黃素、胡 蘿卜素）的分離。三、【實(shí)驗(yàn)材料】 原料： 新鮮的菠菜葉 試劑：無(wú)水乙醇或95%乙醇 5.三氧化1. 二鋁石英砂6 .飽和氯化鈉溶液 丙酮7.水硫酸鈉石油醚（60-90C） 8洗脫液： =1: 9器材：層析柱（1 研缽，蒸餾裝置，脫脂 天平， 燒杯，過(guò)濾漏斗，玻璃 分液漏斗，試管，鐵2.!1!3.nm!1!3. 丙酮：石油醚 X 30cm）, 棉， 棒，錐形瓶， 架臺(tái)四、【實(shí)驗(yàn)操作】1. 色素的提?。?0克菠菜

4、，加少許石英砂，再加20 毫升無(wú)水乙醇研磨成漿，脫脂棉過(guò)濾， 保存濾液，濾渣再用無(wú)水乙醇提取一次，合并濾液，濾渣再加入30毫升石油醚提取一 次，過(guò)濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再加入40 毫升飽和氯化鈉溶液震蕩，棄去下層溶 液，再分別加入20毫升水震蕩洗滌幾次，直至下層無(wú) 色，保留上層溶液，轉(zhuǎn)移至三角瓶中， 加入無(wú)水硫酸鈉干燥5分鐘，備用.樣品的濃縮:2將提取液放入蒸餾燒瓶中，蒸除多 余的石油醚，至剩余液體5-8毫升左右， 以備加樣使丿3. 層析拄的制備：15克堿性三氧化二鋁加入30毫升 石油醚攪拌，浸泡10min.。在層 IR析拄內(nèi)加入一團(tuán)棉花在底部，再加 入石英砂0.5cm以上，然后用石

5、油醚 充滿(mǎn)柱子，再重復(fù)使用下面的石油醚，nm將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)， 倒時(shí)應(yīng)該緩慢， 直到裝完。用石卜樣油醚洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團(tuán)棉花， 然后再填入石英砂0.5厘米高3品的分離層析：吸附層析分離HIR色素 打開(kāi)層析拄下部開(kāi)關(guān)，向拄內(nèi)加 入2毫升濃縮液，至液體沒(méi)入砂內(nèi)，再 加入石油醚沖洗拄壁，液體浸入砂內(nèi)， 加洗脫液開(kāi)始層析，可以看到不同色帶 如圖片1，直至第一條色帶洗脫完畢，在拄 下面用試管接收第一條色帶的洗脫液， 如圖片2。二層析柱中五、【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖：圖出現(xiàn)黃色帶 圖二：提取出的黃色胡蘿 素結(jié)果分析：洗脫過(guò)程中，首先有一條黃色的色 帶圈沿著層析柱下移，色帶圈的各個(gè)方 向

6、的移動(dòng)速度并不是完全相同，原因在于層析柱 的制作過(guò)程并不完全均一，使層析柱內(nèi) 部不均勻，以至于色帶各方向的移動(dòng)速度不同。最后 收集得到亮黃色的胡蘿卜素。七、【注意事項(xiàng)】1、萃取時(shí)不要?jiǎng)×艺袷?，以防止發(fā) 生乳化現(xiàn)象。使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必'要的，2、為了保持柱子的均一性'性。因此要保證否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí)，就會(huì)使柱身干裂, 影響滲透和顯色的均 整個(gè)裝樣過(guò)程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面3、在吸附劑上端加入脫脂棉（或?yàn)V 紙）是使加樣品時(shí)不致把吸附劑沖起； 在吸附柱下端加脫脂棉（或沙子）可以防止吸附 劑細(xì)粒流出。4、層析柱填裝緊密與否，對(duì)分離效 果很有影響，若各部分松

7、緊不勻，會(huì)影 響滲透速度和顯色的均勻。緊凝膠，色素分離不開(kāi)；也不要過(guò) 使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過(guò)程中，凝膠床高度下降, 色素洗脫很慢。因此應(yīng)控制洗脫流速， 以每分鐘60-80滴為宜。7、樣品一定要足夠濃縮，加樣量不 要過(guò)大，過(guò)大，分離條帶過(guò)寬，如果層 析拄不夠長(zhǎng)，各組分不易分開(kāi)，易同時(shí)洗脫下來(lái);6、洗脫流速不宜過(guò)快，避免因此壓 緊凝膠，色素分離不開(kāi)；也不要過(guò)慢，加樣量過(guò)少，色帶不是很清楚，不易觀 察，效果不好。8層析柱粗細(xì)必須均勻，柱管大小 可根據(jù)試劑需要選擇。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)長(zhǎng) 的柱分離效果柱管較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑 較粗的柱，但此時(shí)分離效果稍差。 內(nèi)徑太小時(shí)，會(huì)發(fā)生“管壁效應(yīng)”，即柱管中

8、心部分的 組份移動(dòng)慢，而管壁周?chē)囊苿?dòng)快。柱 越長(zhǎng)，分離效果越好，但柱過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，樣品 稀釋度大，分離效果反而不好八、【實(shí)驗(yàn)小結(jié)】在該柱層析分離色素實(shí)驗(yàn)中，我了 解了柱層析技術(shù)的相應(yīng)方法和原理，學(xué) 會(huì)了層析柱的制作和準(zhǔn)備，進(jìn)一步了解綠葉中色 素的組成及各色素的顏色和性質(zhì)、洗脫 液的配比、層析柱的制作及洗脫液的流速是本實(shí)驗(yàn)成 功與否的二大關(guān)鍵因素。 知識(shí)拓展：1、溶劑的選擇：（1）吸附劑要求較純，否則會(huì)影響 樣品的吸附和洗脫（2）溶劑和吸附劑不能起化學(xué)反應(yīng)。）、二（3）溶劑的極性應(yīng)比樣品小，如果 品不宜被吸附劑吸附（4）溶劑對(duì)樣品的溶解度不能太 大，否則影響吸附，但也不能太小，溶 液的體

9、積增加，易使色譜分散。（5）可使用混合溶劑，如有的組分 含有較多的極性基團(tuán)，在極性小的溶劑 中溶 解度太小。也可選用極性大的溶劑 溶解，然后加入一定量的非極性溶劑 這樣既降低了極性，又減少了溶液的體積。卜樣后 尸用合適 的溶劑進(jìn)行洗脫,這種溶劑稱(chēng)為洗脫劑。 如果原來(lái)用于溶解樣品的溶劑沖洗柱不能達(dá)到 分離的目的，可以改用其他溶劑， 極性較強(qiáng)的溶劑影響樣品和氧化鋁之間的吸附，容易 將樣品洗脫下來(lái)，達(dá)不到分離的目的 因此常用一系列極性漸次增強(qiáng)的溶劑， 既先使用極性最弱的溶劑，然后加入不 同比例的般2、洗脫劑的選擇： 品吸附在氧化鋁柱極性溶劑配成洗脫溶劑。常用的洗 脫溶劑的極性按如下次序遞增。己烷和

10、IR石油醚V環(huán)己烷V!1!四氯化碳V三氯乙烯V二硫化碳V 甲苯V二氯甲烷V氯仿V乙醚V乙酸乙 酯V丙酮V丙醇V乙醇V甲醇V水V吡啶V乙酸。篇 二：實(shí)驗(yàn)六：薄層層析與柱層析 實(shí)驗(yàn)六 薄層層析與柱層析實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解偶氮苯的光學(xué)異構(gòu)反應(yīng)，加 深對(duì)光化學(xué)反應(yīng)的理解。2. 掌握薄層層析的基本操作，薄層 層析分離順、反式偶氮苯。3. 了解柱層析分離有機(jī)化合物的原 理，初步掌握層析柱裝填和洗脫的操作 方法4. 采用柱層析分離反式偶氮苯與靛 紅的混合物實(shí)驗(yàn)原理偶氮苯是最簡(jiǎn) 單的芳香偶氮化合物，眾多偶氮染料的 母體結(jié)構(gòu)。含有兩個(gè)苯基分別與偶氮基-n二n-兩端相連的結(jié)構(gòu)。偶氮 苯有毒，易燃。偶氮苯有順（Z）-

11、反（e） -異構(gòu)體。反式MIR為橙紅色棱形晶體，蒸氣為深紅色， 溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。反式的熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。當(dāng)溶于乙醇的偶氮苯用一定強(qiáng)度的 紫外光照射時(shí)，順式的比例逐漸增大， 直至達(dá)到平衡，形成順?lè)串悩?gòu)體的混合物。偶氮苯的 光致異構(gòu)是很多偶氮類(lèi)功能材料光響應(yīng) 的基礎(chǔ)。順式為橙紅色片狀晶體，不穩(wěn)定，在加熱或 可見(jiàn)光照射下能夠變成反式。色譜方法 是通過(guò)在固定相和流動(dòng)相間分配的不同 而將物質(zhì)分離開(kāi)。待分離混合物各組分在固定相上的吸附強(qiáng)度不同，與流 動(dòng)相一起移動(dòng)的速度也不同，因此被分 離開(kāi)。薄層色譜屬于固-液吸附色譜。薄 層色譜板中的固定相中的微孔結(jié)構(gòu)使得 溶劑在毛細(xì)管作用下能夠沿著色譜板向上移動(dòng)

12、。由 于混合物中各組分對(duì)吸附劑（固定相） 的吸附能力不同，當(dāng)展開(kāi)劑（流動(dòng)相）流經(jīng)吸附劑時(shí) 發(fā)生無(wú)數(shù)次吸附解附過(guò)程，吸附力弱的 組分隨流動(dòng)相迅速最終在固定相薄層析上分離。向前移動(dòng)，吸附力強(qiáng)的組分滯留在 I于各組分具有不同的移動(dòng)速度，tic除了用于分離外，還可以通過(guò)與已知結(jié)構(gòu)的的化合物比 對(duì)，鑒定少量有機(jī)混合物的組成，它也 是柱色譜尋求最佳展1圖中紅色化合物的開(kāi)劑的手段。rf等于豎直紅線(xiàn)的長(zhǎng)度除以豎直藍(lán)線(xiàn)的 長(zhǎng)度。柱層析也屬于固-液吸附色譜。在 一根玻璃“分離柱”中進(jìn)行。管中裝上 適當(dāng)?shù)姆勰┳鳛閲?guó)定相。待分離或純化物質(zhì)的溶液 （流動(dòng)相）在重力作用下流經(jīng)吸附劑時(shí)， 不同物質(zhì)對(duì)溶劑和吸附劑的親和力不同

13、，因而被吸 附的程度不同，從而以不同速度流動(dòng)， 使化合物得以分離。靛紅與偶氮苯在極性上具有較大差 異，從而可以使用極性適中的展開(kāi)劑， 通過(guò)柱層析將二者分離。儀器與試劑呂，分析天平，tic，錐形瓶，毛細(xì)管， 層析柱，棉花，量筒，硅膠，蒸發(fā)皿， 展缸；etoac, IRch2cl2,石油醚，靛紅；請(qǐng)自帶尺子 （用于計(jì)算rf值）顏老師在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前已經(jīng)準(zhǔn)備好的試劑：a.偶氮苯的溶液（15 mg in 1ml etoh）； b. 靛紅的溶液（15 mg in 1ml ch2cl2）;c.靛紅與偶氮苯的均勻混合物（靛紅1.4 g +偶氮苯 3.5 g）。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容a）光照異構(gòu)化取0.1 g反式偶氮苯溶于5

14、 ml無(wú)水乙 醇中，將此溶液放于試管中，密封，置 于可見(jiàn)光下二星期，以便與光照前的溶液進(jìn)行 對(duì)比。b）薄層層析取管口平整的毛細(xì)管吸取光照后的 偶氮苯溶液，在離薄層板邊沿約0.5 cm的起點(diǎn)線(xiàn)上點(diǎn)卜樣。待乙醇揮發(fā)后,樣。再用另一毛細(xì)管吸取未經(jīng)光照 的反式偶氮苯溶液點(diǎn) 將點(diǎn)好樣品的?。?、二八、層板放入內(nèi)襯濾紙的展缸中。展缸 內(nèi)已放置展開(kāi)劑（乙酸乙酯/石油醚 =1/40）。薄層板的點(diǎn)端在下方，浸入展開(kāi)劑，展開(kāi)劑不 要沒(méi)過(guò)起點(diǎn)線(xiàn)，也不要碰到樣品點(diǎn)。待 展開(kāi)劑前沿上升到離板的上端約1 cm處時(shí)，取出薄 層板，立即用鉛筆在展開(kāi)劑上升的前沿 處劃一記號(hào)，置于空氣中晾干。可觀； 到?。?、二層板上經(jīng)光照后的偶氮

15、苯溶液點(diǎn)處上端有兩個(gè)黃色斑點(diǎn)（哪一個(gè)斑點(diǎn)是 順式的？哪一個(gè)斑ethyl點(diǎn)是反式的？）。計(jì)算異構(gòu)體的rf 值。用上述相同的方法，采丿、 acetate : p etroleum ether = 1:1 為展開(kāi) 劑，對(duì)靛紅與偶氮苯的混合物進(jìn)行tlc,為下面 的柱層析選擇展開(kāi)劑。c）柱層析1. 將層析柱固定在鐵架臺(tái)上，一定 要保持柱子豎直。2. 將層析柱洗凈后在柱底部放入一 小團(tuán)脫脂棉花?！?.在錐形瓶中稱(chēng)重7g硅膠（sio2）,并用 ethyl acetate : petroleum ether （1:40） 調(diào)勻。在層析柱的下方放置一個(gè)錐形瓶， 以收集流下的液體。加入少量洗脫劑于 層析柱中，以潤(rùn)

16、濕棉花，使其貼在柱子 下端。4. 打開(kāi)層析柱活塞，控制溶劑下流， 將硅膠懸濁液沿柱子側(cè)壁加入，并用少量的溶劑洗去殘余的硅膠，并加入柱 中。用裝有橡皮管或塞子由下向 二 輕敲擊柱子外壁，將氣泡趕出，使硅膠 填裝均勻。并加壓使硅膠緊密，以獲得較好的分離效果。輕輕敲擊，使硅膠 最上層成均勻平面，然 后用藥匙沿柱 子側(cè)壁，輕輕地、慢慢地在硅膠表面覆 蓋一層海砂（注意：不要破壞硅膠 即。關(guān)閉活塞，備用5.打開(kāi)活塞，當(dāng)溶劑液面降至海砂 表面時(shí)，關(guān)閉活塞。用滴管沿柱子側(cè)壁 加入靛紅與偶氮苯混合物的溶液（稱(chēng)取 40 mg,置于1.5ml的塑的上平業(yè)、豐¥7料樣二品管，加入 1 ml二氯甲烷（ch2c

17、l2）,超聲振蕩使其 溶解）。打開(kāi)活塞，使溶劑液面降至海砂 表面，關(guān)閉活塞。再用少量的展開(kāi)劑洗 塑料樣品管，加入層析譜中，并注意洗去粘附在柱壁上的液滴， 打開(kāi)活塞，流到液面，關(guān)閉活塞。重復(fù) 上述操作，直到將所有化合物沖到硅膠里面。petroleum ether （1:40），打開(kāi)活 保持一定的流速，觀察色帶的6.沿側(cè)壁加入大量的洗脫劑ethyl acetate : 塞，加壓 形成和分離7 當(dāng)?shù)谝粋€(gè)有色帶到達(dá)柱底時(shí)，并 且沒(méi)有流出之前，關(guān)閉活塞，倒空錐形 瓶，打開(kāi)活塞，收集全部色帶。然后， 改用 ethyl acetate : petroleum ether (1:1) 作為洗脫劑。關(guān)閉活塞，換

18、一個(gè)空 的且干凈的錐形瓶，打開(kāi)活塞。 當(dāng)?shù)诙?個(gè)有色帶到達(dá)柱底時(shí)，并且沒(méi)有流出之 前，關(guān)閉活塞，倒空錐形 塞，收集全部色帶三層析分離結(jié)束后，采用tlc對(duì) 上述分離的兩個(gè)溶液進(jìn)行分析，總結(jié)分 離效果。同時(shí)，打開(kāi)層析柱活塞，在加 壓下讓展開(kāi)劑流8瓶，打開(kāi)活 主層析分離結(jié)束。，然后將硅膠 倒入 指定的固體廢物桶中。切勿倒入水槽或 通垃圾桶。預(yù)習(xí)時(shí)的問(wèn)題1. 在薄層層析實(shí)驗(yàn)中，為什么點(diǎn)樣的 樣品斑點(diǎn)不可浸入展開(kāi)劑的溶液中？為 什么進(jìn)行薄層層析時(shí)展缸要蓋上蓋？2. 當(dāng)用混合物進(jìn)行薄層層析時(shí)，如何 判斷各組分的在薄層板上的位置？靛紅 與偶氮苯，哪一個(gè)的極性較強(qiáng)？為什么？3. 柱層析時(shí)柱中若留有空氣或者是

19、填裝不均勻，對(duì)分離效果有何影響？如何避免？4. 偶氮苯和靛紅物理化學(xué)性質(zhì)？毒 性？有什么應(yīng)用？偶氮苯光照異構(gòu)化的 機(jī)理？ why is其它閱讀材料trans-azobenzene more stable than cis-azobenzene?1. 光化學(xué)11由光的作用引起的化學(xué)反應(yīng)近年來(lái) 日益受到人們的重視，光合作用就是最 :要的光化學(xué)反應(yīng)。研究激發(fā)態(tài)分子化學(xué)行為的 光化學(xué)反應(yīng)已經(jīng)成為有機(jī)化學(xué)的一個(gè) 要分支。光不僅可以引起多種多樣的化學(xué)反應(yīng)，合成 各種前所未有的奇妙反應(yīng)分子，而且與 我們的日常生活及生命現(xiàn)象有著密切的聯(lián)系。2. 薄層色譜1. 固定相的選擇氧化鋁和硅膠是薄層層析色譜常用 的固定

20、相。氧化鋁多用于分離堿性或中 性有機(jī)物；而硅膠的吸附性源于表面的si-oh基， 主要用于分離酸性、中性有機(jī)物質(zhì)。薄層色譜用的硅膠有薄層色譜用的硅膠有60g、6ogf254、60h、60hf254 和 60hf254+366竺類(lèi)型，八、中g(shù)表示含有13%硫酸 鈣（作為黏合劑）；h表示不含硫酸鈣； f254表示含有2%無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，在254 nm的紫外光 照射下發(fā)出綠色熒光。與硅膠相似，氧 化鋁也因含有黏合劑或熒光劑而分為氧化鋁h、氧化鋁 g、氧化鋁hf254和氧化鋁gf254等類(lèi)型。 黏合劑除硫酸鈣外，還可用淀粉、羧甲 基纖維素（cmc）。2. 操作方法卜樣點(diǎn)、匕）、二在薄層板一端約1cm處，用

21、鉛筆輕 輕劃一條作為起點(diǎn)線(xiàn)。 溶劑溶解后，用毛細(xì)管吸取樣品溶液，輕輕接觸 到起點(diǎn)線(xiàn)的某一位置 可多點(diǎn)幾次，但要等第一次樣品溶劑揮發(fā)后，再點(diǎn) 第二次。點(diǎn)好樣品后，待溶劑揮發(fā)干凈， 才可以進(jìn)行下面的展開(kāi)過(guò)程。展開(kāi)劑品用易揮發(fā),如果溶液太稀，的選擇I于硅選擇展開(kāi)劑，首先應(yīng)考慮對(duì)被分離 物有一定的溶解度和解吸能力。 膠和氧化鋁都是極性吸附劑，所以展開(kāi)劑的極性 越大，試樣在薄板上移動(dòng)的距離越遠(yuǎn)，rf 值（rf值是一個(gè)化合物在薄層板 開(kāi)劑上升的高度的比二升的高度與展 值）越大。例如， 在分離過(guò)程中常發(fā)現(xiàn)rf太小，說(shuō)明展開(kāi) 劑極性不夠，需要考慮加入一種極性強(qiáng) 的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。發(fā)現(xiàn)rf值太小，說(shuō) 明展開(kāi)劑極

22、性不夠，需要考慮加入一種 極性強(qiáng)的展開(kāi)劑進(jìn)行調(diào)控。常用展開(kāi)劑 的洗脫力由小到大的順序?yàn)椋菏兔选?環(huán)己烷、四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、 乙醚、四氫咲喃、乙酸乙醋 IRniR普、等。丙酮、 正丁醇、乙醇、甲醇、水、冰乙酸、吡 啶、有機(jī)酸等。此外，在展開(kāi)過(guò)程中， 展開(kāi)缸內(nèi)展開(kāi)劑的蒸氣須始終處于飽和 狀態(tài)。一般可用一塊方型濾紙貼于缸壁上（下端浸于展開(kāi)劑 中），蓋好密封一段時(shí)間。取放薄層板應(yīng) 迅速。顯色篇三： 層析知識(shí)總結(jié)柱層析知識(shí)總結(jié)/、 小木蟲(chóng)（金幣+1）:獎(jiǎng)勵(lì)一下，鼓勵(lì)發(fā) 有價(jià)值的話(huà)題篇二：氨基酸的薄層層析實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓 名:XXXXX學(xué) 號(hào): XXXXXXXXXXXXXX 專(zhuān)業(yè)年級(jí)

23、：XXXXXXXXXXXXXXX 組別：第X實(shí)驗(yàn)室生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中 心實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)實(shí)驗(yàn)日期 XXXX-XX-XX合作者評(píng)分XXXX氨基酸的薄層層析實(shí) 驗(yàn)地點(diǎn)指導(dǎo)老師第X實(shí)驗(yàn)室XXX教 師簽名批改日期一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握薄層層析法的實(shí)驗(yàn)原理。2、掌握氨基酸薄層層析法的基本操 作方法。3、掌握如何根據(jù)移動(dòng)速率（Rf值） 來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液） 的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、薄層層析法是色譜分析技術(shù)的一,形成薄層（常用厚度為種。是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì) 均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、 金屬片等）卜樣以彼此分開(kāi)0.25毫米左右）后，在此薄層上進(jìn)行層 析分離的分析方法。一般

24、是將固體吸附 劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。 當(dāng)液相（展開(kāi)溶劑）在固定相上流動(dòng)時(shí)， 由于吸附劑對(duì)不同氨基酸的吸附力不一 樣，不同氨基酸在展開(kāi)溶劑中的溶解度 ，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品 隨著展開(kāi)劑的移動(dòng)速率也不同，因而可 。（即通過(guò)吸附-解吸-再吸附- 再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分 離開(kāi)來(lái)）硅膠吸附薄層層析： 吸附薄層中常用的吸附劑為氧化鋁和硅膠。硅膠：表達(dá)式為SiO2 - XH2Q 層析用硅膠是一種多孑孔性物質(zhì)，它的硅 氧環(huán)交鏈結(jié)構(gòu)表面上密布極性硅醇基（-Si OH）,這種極性的硅醇基能和許 多化合物形成氫鍵而產(chǎn)生吸附.相關(guān)。、匕硅膠吸附薄層層析的特點(diǎn)： 硅膠的吸附能力比氧化鋁稍弱

25、， 其吸附活性也與含水量呈負(fù)，'生、或酸性成分的分離, 硅醇基顯較弱的酸性，因此，硅 膠只能用于中，堿性成分不能用它分離。 硅膠的活化溫度通常為105C 110C，不能過(guò)高。2、氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它 與氨基酸的羧基反應(yīng)生成還原茚三酮、 氨及醛，與此同時(shí)，還原茚三酮又與氨 及茚三酮縮合生成紫紅化合物而使氨基 酸斑點(diǎn)顯色。3、混合氨基酸被分離后在薄層層析 圖譜上的位置用相對(duì)遷移率一 Rf值（rate of flow） _來(lái)表示。層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動(dòng)方向遷移 的距離與溶液前沿的距離之比為 Rf值。即:Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原 點(diǎn)到斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)前沿的距

26、離由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù) 是一定的，故移動(dòng)速率（Rf值）也是恒 定的，因此可以根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物!1!1!niR!1!1!質(zhì)。2、材料與方法：（一）、材料：分析樣品（氨基酸混氨酸）、展開(kāi)-合液）、吸附劑（硅膠）、粘合劑（0.5% 的羧甲基纖維素鈉）、氨基酸的異丙醇溶 液（丙氨酸、精氨酸、甘 顯色劑（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶 液）；（二）、器材：層析板（5cm X 15cm） 尺子、鉛筆、小燒杯、玻棒、量筒（10ml）、 吹風(fēng)機(jī)、毛細(xì)玻璃管、層析缸、藥匙、 烘箱；（三）、方法：1、實(shí)驗(yàn)流程：2、操作步驟：（1）（2）（3）（4）四、結(jié)果與討論：卜樣薄層板的制備： 占 八、 層析

27、 顯色（一）結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：篇三：柱層析、薄層層析 主色譜、薄層色譜、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解色譜法分離提純有機(jī)化合物 的基本原理和應(yīng)用。2、掌握柱層析、薄層層析的操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理色譜法（Chromatography）亦稱(chēng)色 層法、層析法等。色譜法是分離、純化和鑒定有機(jī)化 合物的重要方法之一。色譜法的基本原 理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的 吸附或溶解性能（分配）的不同，或其 親和性的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該 種物質(zhì)進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配作用，從 而使各組分分離。色譜法在有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用主要包 括以下幾方面：可得到滿(mǎn)意的結(jié)果1、分離混合物 一些結(jié)構(gòu)類(lèi)似、理 化性質(zhì)也相似的化合物組成的混合物

28、， 一般應(yīng)用化學(xué)方法分離很困難，但應(yīng)用 色譜法分離，有時(shí)制提純化合物有機(jī)化合物中 含有少量結(jié)構(gòu)類(lèi)似的雜質(zhì)，不易除去， 可利用色譜法分離以除去雜質(zhì)，得到純 品。3、鑒定化合物在條件完全一致的 情況，純粹的化合物在薄層色譜或紙色 譜中都呈現(xiàn)一定的移動(dòng)距離，稱(chēng)比移值 （Rf值），所以利用色譜法可以鑒定化合等。物的純度或確定兩種性質(zhì)相似的化合物 是否為同一物質(zhì)。但影響比移值的因素 很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大 小，酸堿性，活性等級(jí)，外界溫度和展 開(kāi)劑純度、組成、揮發(fā)性等。所以，要 獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此， 在測(cè)定某一試樣時(shí)，最好用已知樣品進(jìn) 行對(duì)照。4、觀察一些化學(xué)反應(yīng)是否完成，可 以

29、利用薄層色譜或紙色譜觀察原料色點(diǎn) 的逐步消失，以證明反應(yīng)完成與否。,而后用溶劑洗脫或展開(kāi),柱色譜常用的有吸附色譜和分吸附色譜主要是以氧化鋁、硅膠 為吸附劑，將一些物質(zhì)自溶液中吸附到 它的表面 利用不同化合物受到吸附劑的不同吸附 作用，和它們?cè)谌軇┲胁煌娜芙舛龋?也就是利用不同化合物在吸附劑上和溶 液之間分布情況的不同而得到分離。吸 附色譜分離可采用柱色譜和薄層色譜兩 種方式。配色譜兩種。吸附色譜常用氧化鋁和硅 膠為吸附劑。分配色譜以硅膠、硅藻土 和纖維素為支持劑，以吸收較大量的液 體作為固定相。柱色譜常用的吸附劑有氧化鋁、硅中性和堿,、匕niRHIR!1!1!V級(jí)的吸II , III膠、氧化

30、鎂、碳酸鈣和活性炭等。供色 譜使用的氧化鋁有酸性、種。堿性氧化鋁適用于碳?xì)浠衔?、?物堿以及其它堿性化合物的分離。中性 氧化鋁應(yīng)用最廣，適用于醛、酮、醌以 及酯類(lèi)化合物的分離。酸性氧化鋁適用 于有機(jī)酸類(lèi)的分離。氧化鋁的活化分IV 五級(jí)，I級(jí)的吸附作用太強(qiáng)， 附作用太弱。所以一般常采用 級(jí)。化合物的吸附性和它們的極性成正 比，化合物分子中含有極性較大的基團(tuán) 其吸附性較強(qiáng)。氧化鋁對(duì)各種化合物的 吸附性按下列順序遞減。酸、堿>醇、胺、硫醇>酯、醛、酮lill；gt;芳香族化合物>鹵代物、醚>烯>飽和烴。試樣吸附在氧化鋁柱 的溶劑

31、進(jìn)行洗脫，這種溶劑稱(chēng)為洗脫劑。 常用洗脫溶劑的極性按以下次序遞增：己烷、石油醚V環(huán)已烷V四氯化碳 V三氯乙烯V二硫化碳V甲苯V苯V二 氯甲烷V三氯甲烷V乙醚V乙酸乙酯V 丙酮V丙醇V乙醇V甲醇V水V吡啶V 乙酸 IR!1!后，用合適薄層色譜又叫薄板層析，是色譜法 中的一種，是快速分離和定性分析少 物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固-液 吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的 優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品（幾微克， 甚至0.01微克）的分離；另一方面在制 作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，又可 用來(lái)精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性 較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣 相色譜分析的物質(zhì)。此外，薄層色譜法 還可用

32、來(lái)跟蹤有機(jī)反應(yīng)及進(jìn)行柱色譜之 前的一種“預(yù)試”。，口果、活化后點(diǎn)上待分離的樣品。當(dāng)）、二薄層色譜分為薄層吸附色譜與薄層 分配色譜兩種，本節(jié)介紹的是薄層吸附 色譜。薄層色譜是將吸附劑均勻地涂在 玻璃板（或某些高分子薄膜）上作為固定 相，經(jīng)干燥 用適當(dāng)極性的有機(jī)溶劑作為展開(kāi)劑（即 流動(dòng)相）。當(dāng)展開(kāi)劑在吸附劑上展開(kāi)時(shí)， 品中各組分對(duì)吸附劑吸附能力不 同，發(fā)生了無(wú)數(shù)次吸附和解吸過(guò)程，吸 附能力弱的部分（即極性較弱的）隨流 動(dòng)相迅速向前移動(dòng)，吸附能力強(qiáng)的組分 （即極性較強(qiáng)的）移動(dòng)慢。利用各組分在展開(kāi)劑中溶解能力和被吸附能力的不同，最終將各組分彼 此分開(kāi)。如果卜樣的。各組分本身有顏色則薄層板干燥后 會(huì)出現(xiàn)

33、一系列高低不同的斑點(diǎn)，如果本 身無(wú)色，則可用各種顯色方法使之顯色， 以確定斑點(diǎn)位置。在薄板上混合物的每 個(gè)組分上升的高度與展開(kāi)劑上升的前沿 之比稱(chēng)為該化合物的R f值，又稱(chēng)比移 值。對(duì)于一個(gè)化合物當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件相同時(shí) 其 R f值是薄層色譜最常用的吸附劑是硅膠及 氧化鋁。硅膠是無(wú)定形多孔物質(zhì)。略具酸性， 適用于中性或者酸性物質(zhì)的分離，薄層 色譜用的硅膠可分為：硅膠H-不含粘合劑和其他添加劑。硅膠G-含煅燒石膏(CaS04 1/2H2O)、粘合劑。硅膠HF254-含熒光物質(zhì)，可在波長(zhǎng) 254nm紫外光下觀察熒光。硅膠GF254-含煅燒石膏及熒光物質(zhì)。與硅膠相似氧化鋁也因含粘合劑或 熒光劑而分為氧化鋁

34、G及GF254及氧化 鋁HF254氧化鋁的極性比硅膠大，比較適用分離極性小的化合物。通常將薄板按加粘合劑和不加粘合 劑分為兩種，加粘合劑的薄層稱(chēng)硬板， 不加粘合劑的稱(chēng)軟板。常用的粘合劑除 煅燒石膏外還有淀粉、羧甲基纖維素鈉(CMC)?；衔锏奈侥芰εc它們的極性成 正比，極性大則與吸附劑的作用強(qiáng)，隨 展開(kāi)劑移動(dòng)慢，Rf值??；反之極性小則 Rf值大，因此利用硅膠或氧化鋁薄層色 譜可把不同極性的化合物分離，甚至結(jié) 構(gòu)相近的順、反異構(gòu)體也可分開(kāi)三、基本操作：(含儀器裝置和主要 流程圖)1、柱色譜操作步驟：(1) (2)(3)柱色譜裝置(1 )裝柱：取清潔、薄層板在不同的層析缸中展開(kāi)的方 式蓋-層厚約

35、一張比柱直徑略 幣后將氧化鋁裝入管內(nèi)燥色譜柱, 在玻璃管底鋪一層玻璃棉或脫脂棉，輕 輕塞緊，再在玻璃棉上 0.5cm的石英砂(或丿 小的濾紙代替)，(濕法或干法)。濕法裝柱：是將備用的溶劑裝入管 內(nèi)，約為柱高的四分之三，而后將氧化 鋁和溶劑調(diào)成糊狀，慢慢地倒入管中。 此時(shí)應(yīng)將管的下端旋塞打開(kāi)干法裝柱：是在管的上端放一干燥漏斗，使氧化鋁均勻地經(jīng)干燥漏斗成一 細(xì)流慢慢裝入管中，中間不應(yīng)間斷，時(shí) 時(shí)輕輕敲打柱身，使裝填均勻，全部加 入后，再加入溶劑，使氧化鋁全部潤(rùn)濕 另外也可先將溶劑加入管內(nèi)，約為柱高 的四分之三處，而后將氧化鋁通過(guò)一粗 頸玻璃漏斗慢慢倒入并輕輕敲擊柱身。 此法較簡(jiǎn)便卜樣（2）加樣：

36、把要分離的試樣配制成 適當(dāng)濃度的溶液。將氧化鋁上多余的溶 劑放出，直到柱內(nèi)液體表面到達(dá)氧化鋁 表面時(shí)，停止放出溶劑。沿管壁加入試溶液，注意不要使溶液把氧化鋁沖松 浮起，試樣溶液加完后，開(kāi)啟下端旋塞， 使液體漸漸放出，至溶劑液面和氧化鋁 表面相齊（勿使氧化鋁表面干燥）即可 用溶劑洗脫（3）洗脫和分離：在洗脫和分離的 彳寸程中 應(yīng)當(dāng)注意： '不斷加入洗脫劑，并保持一定高旦流干，再加溶劑， 匚氣泡和裂縫，影響分度的液面，在整個(gè)操作中勿使氧化鋁表 面的溶液流干，- 易使氧化鋁柱產(chǎn)生 離效果?？芍苯佑^察。洗脫后 收集洗脫液，如試樣各組分有顏 色，在氧化鋁柱分別收集各個(gè)組分。在多數(shù)情況下，化 合物

37、沒(méi)有顏色，收集洗脫液時(shí)，多采用 等份收集，每份洗脫劑的體積隨所用氧 化鋁的量及試樣的分離情況而定。個(gè)柱 控制洗脫液的流出速度，一般不 宜太快，太快了柱中交換來(lái)不及達(dá)到平 衡，因而影響分離效果。 由于氧化鋁 表面活性較大，有時(shí)可能促使某些成分 破壞，所以應(yīng)盡量在一定時(shí)間內(nèi)完成一主色譜的分離，以免試樣在柱上停留的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，發(fā)生變化。2、薄層色譜操作步驟： IR卜樣尸小、，垂直輕輕的點(diǎn)在起點(diǎn)線(xiàn) 溶液太稀。一次點(diǎn)樣不夠，則可待前一。若 點(diǎn)樣 在距薄板一端1cm處用鉛 筆輕輕劃一橫線(xiàn)作為起始線(xiàn)。將樣品溶 于低沸點(diǎn)溶劑（如甲醇、乙醇、丙醇、 氯仿、苯、乙醚及四氯化碳）配成 1%左 右的溶液，用內(nèi)徑1mm管

38、口平齊的毛細(xì) 管占l=r 八、次試樣點(diǎn)干后，在原點(diǎn)樣處再點(diǎn)，點(diǎn)樣 后的直徑不要超過(guò)2mm,點(diǎn)樣斑點(diǎn)過(guò)大， 往往會(huì)造成脫尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，影響分 離效果。一塊薄層板可以點(diǎn)多個(gè)樣，但 點(diǎn)樣點(diǎn)之間距離以0.51.5cm為宜。展開(kāi)劑的選擇和展開(kāi)、展開(kāi)劑的根據(jù)樣品的極性、溶解度和因素。溶液的極性越大，選擇主要 吸附劑的活， 則對(duì)化合物解吸的能力越強(qiáng)，也就是說(shuō) R f值也越大。如果出現(xiàn)樣品各組分R f 值都較小，則可加入適量極性較大的溶 劑。晾干。（3）顯色晾干后若分離的化合物本 身有色，在薄層板 分斑點(diǎn)。如果本身無(wú)色，用的是含熒光可看到分開(kāi)的各組薄層色譜的展開(kāi)需要在密閉容器內(nèi) 進(jìn)行。將選擇的展開(kāi)劑倒入層析

39、槽或?qū)?析缸中（液層高度約為0.5cm）,待容器 內(nèi)容積蒸汽達(dá)到飽和后，再將點(diǎn)好的薄 層板放入槽或缸中進(jìn)行展開(kāi)（含粘合劑 的板可傾斜45°60°角）,注意點(diǎn)樣的 位置必須要在展開(kāi)劑液面之上。當(dāng)展開(kāi) 劑展開(kāi)，其前沿上升到板頂端 510mm 處時(shí)，取出薄板，用鉛筆劃處前沿的位 置、劑的薄層板在紫外光下一般呈暗色斑 點(diǎn)；有時(shí)用腐蝕性的顯色劑如濃硫酸、 濃鹽酸和濃磷酸等顯色；也可待溶劑揮 發(fā)后的薄板放入有幾粒碘并充滿(mǎn)碘蒸汽 的密閉容器中許多化合物都能與碘形成 黃色斑點(diǎn)，但要注意當(dāng)?shù)庹羝麚]發(fā)后斑 點(diǎn)易消失。除此之外，也可以在薄層板 上溶劑蒸發(fā)前噴霧顯色。用各種顯色方法使斑點(diǎn)出現(xiàn)后，應(yīng) 立即用鉛筆劃出斑點(diǎn)的位置，并計(jì)算R 值。1 、柱四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：主層析(1) 試劑熒光黃和堿性湖藍(lán)BB的分離 分離樣品：0