極性C18-親水作用色譜-強(qiáng)極性化合物分離專題-2013

1、1極性小分子分離分析極性小分子分離分析專題講座強(qiáng)極性小分子分析難點(diǎn)1.我的樣品是兩性極性小分子化合物，反相柱不保留，怎樣選擇合適的色譜柱分析。關(guān)鍵詞：不保留2.我的樣品分析條件比較特殊，必須要進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，要選擇可以進(jìn)質(zhì)譜的分析條件。關(guān)鍵詞：質(zhì)譜兼容強(qiáng)極性小分子分析難點(diǎn)中強(qiáng)極性化合物強(qiáng)極性化合物一般極性化合物普通反相模式C18/C8可解決部分化合物在純水條件下反相模式解決在反相上無(wú)保留，正相不溶解，難點(diǎn)問(wèn)題：疏水塌陷問(wèn)題：不保留，不溶解強(qiáng)極性小分子分析解決方案C18 甲醇中C18 水中強(qiáng)極性小分子分析解決方案選用親水性和極性很強(qiáng)的封尾試劑封尾避免疏水塌陷的幾個(gè)策略選用短鏈烷基鍵合相且不對(duì)硅醇基

2、封尾選用鏈長(zhǎng)更長(zhǎng)的烷基固定相選用大孔硅膠對(duì)烷基鏈固定相進(jìn)行極性基團(tuán)嵌入的改造強(qiáng)極性小分子分析解決方案一步法反應(yīng)較好保持了烷基鏈的疏水性可調(diào)的極性基團(tuán)種類和數(shù)量增加了材料的穩(wěn)定性Polar-copolymerized極性共聚Polar-embeded 極性包埋Polar-endcapped極性封尾破壞了烷基破壞了烷基鏈的疏水性鏈的疏水性兩步反應(yīng)，極性兩步反應(yīng)，極性基團(tuán)數(shù)量不可控基團(tuán)數(shù)量不可控利用極性共聚技術(shù)研發(fā)出耐水的XAqua 系列色譜柱強(qiáng)極性小分子分析解決方案停流實(shí)驗(yàn)強(qiáng)極性小分子分析解決方案原兒茶醛色譜條件：色譜柱：XAqua C18(150 4.6 mm，5m mm)流動(dòng)相：乙腈：1%醋酸

3、水溶液=5:95；柱溫：30C;流速:1.0 mL/min;強(qiáng)極性小分子分析解決方案小分子酸色譜條件：色譜柱：XAqua C18；流動(dòng)相：100%（0.1%三氟乙酸水）；強(qiáng)極性小分子分析解決方案中性或酸性極性小分子化合物XAqua 系列堿性極性小分子化合物解決XAqua 系列051015200.00.10.20.30.40.5AuRetention Time/min拖尾一般解決辦法流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑質(zhì)譜不兼容強(qiáng)極性小分子分析解決方案堿性化合物拖尾的原因，殘余硅醇基與堿性化合物作用造成拖尾針對(duì)堿性化合物，研發(fā)出專用堿性化合物的分離分析的色譜柱 XCharge 系列設(shè)計(jì)理念：合理控制電荷密度，

4、設(shè)計(jì)理念：合理控制電荷密度，形成恰當(dāng)?shù)碾姾善帘螌?，消除硅形成恰?dāng)?shù)碾姾善帘螌?，消除硅醇基的拖尾影響，?shí)現(xiàn)載樣量的醇基的拖尾影響，實(shí)現(xiàn)載樣量的提升。提升。強(qiáng)極性小分子分析解決方案羥氨芐青霉素色譜條件：色譜柱：XCharge C18；流動(dòng)相：A 0.1%甲酸水，B0.1%甲酸甲醇；梯度：020 min，5%B95%B強(qiáng)極性小分子分析解決方案磺胺類堿性小分子色譜條件：色譜柱：XCharge C18；流動(dòng)相：A 0.1%甲酸水，B乙腈；梯度：030 min，5%B95%B強(qiáng)極性小分子分析解決方案超強(qiáng)極性怎么辦，反相純水條件下不保留HILIC 模式XAqua C18流動(dòng)相：流動(dòng)相：100%水水XAmid

5、e流動(dòng)相：流動(dòng)相：85%乙腈水乙腈水強(qiáng)極性小分子分析解決方案增加保留與反相不同保留機(jī)理正交性更好的溶解度和質(zhì)譜兼容性強(qiáng)極性小分子分析解決方案15.16816.850LSU0.0020.0040.0060.0080.00100.00分鐘0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00色譜柱色譜柱：XAmino，250 mm 4.6 mm，5 mm流動(dòng)相流動(dòng)相：A:乙腈 B：水等度等度：A/B = 85:15流速流速：1.0 mL/min柱溫柱溫：35 oC選擇性選擇性：1.12分離度分離度：3.08甘露醇山梨醇強(qiáng)極性小分子分析解決方案

6、色譜柱色譜柱：XAmide，250 mm 4.6 mm，5 mm流動(dòng)相流動(dòng)相：A: 磷酸鹽緩沖液 B：乙腈 等度等度：A/B = 30:70流速流速：1.0 mL/min 柱溫柱溫：35 oC左旋肉堿強(qiáng)極性小分子分析解決方案未知極性小分子化合物XAqua C18拖尾XCharge C18XAmideS-Click XIon不保留拖尾反相模式親水模式方案特點(diǎn)1.該方案基本適用于所有極性小分子化合物，普試性好。2.該方案所有流動(dòng)相都可應(yīng)用于質(zhì)譜，質(zhì)譜兼容性好。3.采用兩種模式，增加了樣品的選擇性。強(qiáng)極性小分子分析解決方案樣品1樣品為某CRO公司提供合成中間體小分子化合物XAqua C18100%甲

7、酸水XCharge C18100%甲酸水S-Click XIon乙腈甲酸銨體系放大圖拖尾不保留保留好，分離好強(qiáng)極性小分子分析解決方案樣品2樣品為某CRO公司提供合成中間體小分子化合物XAqua C18乙腈甲酸水主峰純度96.55%S-Click XIon乙腈甲酸水主峰純度84.91%分離度差保留適中分離度良好AU0.000.200.400.600.801.00分鐘5.0010.0015.0020.0025.0030.00強(qiáng)極性小分子分析解決方案樣品3樣品為某CRO公司提供合成中間體小分子化合物XAqua C18100%甲酸水主峰純度96.55%XCharge C18100%甲酸水主峰純度96.

8、55%分離度差保留弱分離度差保留適中分離度良好22親水作用色譜與中藥中強(qiáng)極性化合親水作用色譜與中藥中強(qiáng)極性化合物的分離物的分離專題講座主要內(nèi)容親水作用色譜保留機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜保留機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用中藥中強(qiáng)極性化合物的分離中藥中強(qiáng)極性化合物的分離研究方向研究方向強(qiáng)極性化合物的分離強(qiáng)極性化合物的分離反相色譜反相色譜正相色譜正相色譜溶解度溶解度與質(zhì)譜聯(lián)用與質(zhì)譜聯(lián)用？A.J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.親水作用色譜親水作用色譜HILIC親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜親水作用色

9、譜 親水作用色譜法的分離原理與正相色譜法相近的極性固定相、以高比例極性有機(jī)溶劑和低比例水的混合溶液為流動(dòng)相，主要用于極性化合物的分離。被分析物質(zhì)在色譜柱中的保留和其自身的極性成正比，和流動(dòng)相的極性成反比。被分析物質(zhì)的極性越強(qiáng)，在色譜柱中保留越強(qiáng)。增加流動(dòng)相中水的比例，使流動(dòng)相極性增強(qiáng)，則分析物保留減弱。親水色譜固定相親水色譜固定相( 1) 傳統(tǒng)的正相色譜固定相，包括純硅膠固定相、氨基鍵合相、二醇基鍵合相、氰基固定相。該類固定相對(duì)糖、有機(jī)酸、核苷等強(qiáng)極性化合物表現(xiàn)出良好的分離選擇性; ( 2) 離子交換固定相，該類固定相具有很好的親水性，表面帶有較強(qiáng)的表面電荷，用于親水作用色譜時(shí)表現(xiàn)為一種離子交

10、換( 或排斥) /親水作用混合色譜模式; ( 3) 專門(mén)應(yīng)用于親水作用色譜的固定相，包括酰胺類固定相、醇羥基固定相和兩性離子固定相。酰胺類固定相可用于分離核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇及有機(jī)酸等親水化合物; 醇羥基固定相適合于分離各種糖，如單糖、二糖、糖醇、寡糖及堿基、核苷、肽和中藥中的強(qiáng)極性組分。min010203040mAU0100200300400500強(qiáng)極性化合物反相模式分離ODS Column 1.000mL/minA: 0.1% 甲酸甲酸/ /水水 B: 乙腈乙腈 時(shí)間/分鐘03050B/%53070親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)川芎強(qiáng)極性成分反相模式分離，川芎強(qiáng)極性成分

11、反相模式分離，UV檢測(cè)檢測(cè)（260nm）吸附吸附親水作用色譜保留機(jī)理親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)分配分配極性固定相極性固定相富水層富水層流動(dòng)相流動(dòng)相極性固定相極性固定相溶質(zhì)溶質(zhì)A. J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71Y. Guo, J. Pharm. Biomed. Anal. 31（2003）1191T.Yoshida, J. Biochem. Biophys. Meth. 60（2004）265反相液相色譜反相液相色譜正相液相色譜正相液相色譜毛細(xì)管電色

12、譜毛細(xì)管電色譜 離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜親水作用色譜特點(diǎn)HILIC強(qiáng)極性組分強(qiáng)極性組分親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)親水作用色譜機(jī)理及特點(diǎn)好的保留好的保留好的溶解度好的溶解度流動(dòng)相簡(jiǎn)單流動(dòng)相簡(jiǎn)單大的制備規(guī)模大的制備規(guī)模親水作用色譜影響因素固固 定定 相相有有 機(jī)機(jī) 溶溶 劑劑緩緩 沖沖 鹽鹽pH柱柱 溫溫親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用(A) Keystone Carbohydrate, (B) Asahipak NH2P,(C) BetaBasic Cyano, (D) Metasil Cyano, (E) TSKGel Amide-80,(F) Cyclobond III, (G)

13、 Polyhydroxyethyl Aspartamide 0-40min， ACN：90-75%；40-80min，ACN：75%terreic acidoosporeinguanine nocardicin Acephalosporin Cvancomycin固定相對(duì)親水模式分離的影響M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用有機(jī)溶劑對(duì)親水模式分離的影響(1) epidaunorubicin, (2) daunorubicin, (3) epirubicin, (4) doxorubicinKroma

14、sil KR100-5SIL 10% HCOONa buffer (20 mM, pH 2.9)R. P. Li, J. Chromatogr. A, 1041 (2004) 163親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用有機(jī)溶劑對(duì)親水模式分離的影響aspirincytosineTSKgel Amide-80YMC-Pack NH2HILIC Silica ZIC-HILIC5mM ammonium acetate，30Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用緩沖鹽對(duì)親水模式分離的影響親水作用色譜

15、影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用terreic acidoosporeinguanine nocardicin Acephalosporin CvancomycinA: 6.5mM 三氟乙酸；三氟乙酸；B: 7.9mM 甲酸銨甲酸銨 pH 4.4C: 6.5mM 乙酸銨乙酸銨 pH 5.5；D: 6.3mM 碳酸氫銨碳酸氫銨 pH 7.9TSK Gel Amide 80 column0-40min， ACN：90-75%；0-80min，ACN：75%M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439pH對(duì)親水模式分離的影響Retention of BTE

16、AC as a function of pH Atlantis silica 85% ACN-0.1M NH3 pH adjusted with formic acidACN0.1M HCOONH4, pH 8.210.2D.V. McCalley J. Chromatogr. A 1171（2007）46Analysis of test solutes on Atlantis silica親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用柱溫對(duì)親水模式分離的影響aspirincytosineTSKgel Amide-80YMC-Pack NH2HILIC Silica ZIC-HILICA

17、CN/water: 90/10(10mM ammonium acetate)Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜應(yīng)用血漿中葉酸化合物的檢測(cè)Nest Group HILIC column，乙腈乙腈/ /水水（75：25）5mM乙酸銨乙酸銨，pH 6.9S.D.Garbis，Anal. Chem. 73（2001）5358親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用單糖、寡糖分離單糖、二糖分離單糖、二糖分離 氰基柱氰基柱 乙腈乙腈/ /水水/ /甲酸銨甲酸銨 (240 mM, pH 3.0

18、) 76:23:1麥芽寡糖分離麥芽寡糖分離 氨基柱氨基柱 乙腈乙腈/ /水水/ /甲酸銨甲酸銨 (240 mM, pH 3.0) 70:29:1A. H. Que， Anal. Chem. 74（2004）5184 親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用糖基磷脂酰肌醇錨蛋白（GPI-APs）分離（A）HILIC eluate；（B）PNGase F-treated HILIC eluateM. J. Omaetxebarria, Anal. Chem. 78 (2006) 3335親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用MALDI-TOF mass spectra o

19、f peptides from MDP tryptic digest皂樹(shù)皂苷分離（HILICHILIC-Q-TOF-MS模式）Y. Wang, J. Chromatogr. A, 1181 (2008) 51親水作用色譜影響因素及應(yīng)用親水作用色譜影響因素及應(yīng)用中藥中強(qiáng)極性化合物的分離各種親水色譜固定相用于中藥水提樣品的分離色譜柱固定相應(yīng)用Atlantis HILICsilica甘草、葛根中黃酮類化合物的分離Venusil HILIC酰胺川芎、紅花水提樣品分離-CD環(huán)糊精枳實(shí)、黃芩水提樣品，甘草、葛根中黃酮類化合物的分離川芎親水指紋圖譜研究 川芎樣品預(yù)處理方法優(yōu)化川芎樣品預(yù)處理方法優(yōu)化 方法學(xué)考

20、察方法學(xué)考察 川芎指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)川芎指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)中藥中親水化合物的分離中藥中強(qiáng)極性化合物的分離 川芎樣品預(yù)處理方法優(yōu)化川芎樣品預(yù)處理方法優(yōu)化川芎水提液川芎水提液95%乙腈乙腈上清液上清液中等、弱極性中等、弱極性反相模式分離反相模式分離川芎指紋圖譜川芎指紋圖譜沉淀沉淀 70% 甲醇甲醇 醇溶液醇溶液強(qiáng)極性強(qiáng)極性親水模式分離親水模式分離川芎指紋圖譜川芎指紋圖譜中藥中強(qiáng)極性化合物的分離川芎中等、弱極性成分反相模式分離（上圖）；川芎中等、弱極性成分反相模式分離（上圖）；強(qiáng)極性成分反相（中圖）、親水模式分離（下圖），強(qiáng)極性成分反相（中圖）、親水模式分離（下圖），UV檢測(cè)檢測(cè)（260nm）min

21、10203040mAU0204060801001110987654321川芎指紋圖譜川芎指紋圖譜min010203040mAU051015202512345678109川芎指紋圖譜川芎指紋圖譜min010203040mAU0100200300400500 方法學(xué)考察序號(hào)R.S.D .(%)精密度(n=5)重現(xiàn)性(n=5)穩(wěn)定性(n=7)10.260.110.3720.220.070.3530.110.070.3340.110.050.3050.130.050.2760.090.050.2570.110.040.2080.090.040.1690.060.020.10100.050.020.10110.050.020.08序號(hào)R.S.D. (%)精密度(n=5)重現(xiàn)性(n=5)穩(wěn)定性(n=7)10.690.240.6021.330.971.3831.351.071.3340.490.340.5650.540.720.4760.400.44