樹突狀細(xì)胞-轉(zhuǎn)移癌融合疫苗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌探究1

1、1樹突狀細(xì)胞 /結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞融合疫苗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究孫新平 ,丁曉煜 ,趙文鵬 ,朱宗迅 ,李淵 ,張?zhí)熹h(武警甘肅總隊(duì)醫(yī)院醫(yī)務(wù)處 甘肅 蘭州 730050) 【摘 要】目的： 通過建立人免疫重建荷人結(jié)腸癌皮下種植瘤嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID)小鼠模型，研究 DC/結(jié)腸癌融合疫苗對人轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的發(fā)展及預(yù)后的影 響。方法：應(yīng)用腹腔注射法對嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 SCID 小鼠注射人外周血淋巴細(xì) 胞( hu_PBL)免疫重建后，皮下注射法建立荷人結(jié)腸癌皮下種植瘤模型。應(yīng)用 聚乙二醇( PEG) 制備 DC/SW620融合疫苗。將 DC/SW620融合疫苗于左、右后足 底、尾根部皮下三

2、點(diǎn)注射在人免疫重建的 SCID小鼠結(jié)腸癌皮下移植瘤模型。酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( ELISA)檢測小鼠血清中人 IgG 含量；通過直接測量法觀察人 結(jié)腸癌皮下種植瘤成瘤性和小鼠生存期。 結(jié)果：融合疫苗治療組的皮下腫瘤體積 生長速度慢于其他各對照組；融合疫苗治療組生存期為( 109.00 ±17.17 )d，明 顯長于單純制模組( 55.67 ± 12.03 ，P< 0.001 )、免疫重建組( 81.83±9.06，P< 0.001 )、腫瘤細(xì)胞疫苗組( 87.33 ±12.85 ，P< 0.01 )。結(jié)論： DC/SW620融合疫苗 可抑

3、制腫瘤生長，改善預(yù)后， DC/SW620融合疫苗比腫瘤細(xì)胞凍融物免疫治療效 果更佳。 關(guān)鍵詞 結(jié)腸癌；樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞融合；嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠 中圖分類號(hào) R392.12 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一， 其發(fā)病率、死亡率在西方發(fā)達(dá)國家分別居惡 1-2性腫瘤的第 3位和第 2位1-2 。目前除外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法外， 免疫 治療作為輔助治療新途徑， 日益受到研究者的關(guān)注。 它治療的靶點(diǎn)和毒性作用與 傳統(tǒng)治療措施沒有重疊 , 靶向性好，產(chǎn)生的記憶性免疫效應(yīng)細(xì)胞可預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。 其中樹突狀細(xì)胞 /腫瘤細(xì)胞融合疫苗在針對多種惡性腫瘤的研究中取得了抗腫瘤2 、3-5作用2 、3-5

4、 。本研究擬通過建立人免疫重建荷人結(jié)腸癌皮下種植瘤 SCID小鼠模型， 研究 DC/結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌融合疫苗對人結(jié)腸癌發(fā)展以及預(yù)后的影響。1 材料和方法1.1 材料 SCID小鼠：無免疫滲漏 ( IgG < 1g/ ml)的 C.B17/SCID 純系小鼠，雄1 作者簡介： 孫新平( 1962 )，男(漢)，甘肅秦安，主任醫(yī)師，碩士，胸心外科專業(yè)。2 聯(lián)系地址： 蘭州市龔家灣建蘭新村 251 號(hào)武警醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，電話： E-mail:sunxinping2性，46周齡， 30只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于無特殊 病原體（ SPF）環(huán)境（北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)

5、物實(shí)驗(yàn)中心） ，飼料、飲水、墊料等均 經(jīng)無菌消毒。人結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株 SW620 由上海細(xì)胞所購入。健康人濃縮白細(xì) 胞，購自北京市紅十字會(huì)中心血站。 50%聚乙二醇（ PEG）購自 Sigma 公司（美 國）。人 IgG ELISA 試劑盒購自 Pierce 公司（美國）。其他試劑為市售高級(jí)試劑。1.2 方法1.2.1 人外周血淋巴細(xì)胞（ hu-PBL）及 DC 的分離培養(yǎng)：用淋巴細(xì)胞分層液密度 梯度離心法從健康人濃縮白細(xì)胞中分離出人外周血單個(gè)核細(xì)胞，以含5%人血清的 RPMI1640 培養(yǎng)，24h 后吸取未貼壁細(xì)胞（主要為淋巴細(xì)胞） ，用 RPMI1640+5% 人血清培養(yǎng)，并加入 20U/

6、ml IL-2 培養(yǎng) 24 小時(shí)后用以對 SCID 小鼠的免疫重建； 貼壁的細(xì)胞則繼續(xù)用 RPMI1640+5% 人血清培養(yǎng)，并加入 1000U/ml rhGM-CSF 和 1000U/ml IL-4 ，培養(yǎng)第 6天加入 TNF-800U/ml 使樹突狀細(xì)胞成熟。1.2.2 DC/SW620 融合疫苗的制備：結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株 SW620 以含 5%胎牛血清 的 RPMI1640 培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。 DC 與 SW620細(xì)胞按 1:3 的比例混合，室溫 下用 PEG 融合法融合。1.1.3 免疫重建荷人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型建立及治療： （ 1）實(shí)驗(yàn)分組：將 30 只 SCID 小鼠隨機(jī)分為 A

7、 假手術(shù)組、 B 單純制模組、 C 免疫重建組、 D 融合疫苗治 療組、E腫瘤細(xì)胞疫苗組五組， 每組 6只。（2）腹腔注射法免疫重建： 在第1周， C、D、E 組腹腔注射 300 L 含 3×107hu_PBL 的 PBS，A、B 組腹腔注射等量不 含 hu_PBL 的 PBS。（3）皮下注射法建立結(jié)腸癌皮下種植瘤模型： 第 2 周，B、C、 D、E組小鼠于右腋下注射 150 L含5×106SW620細(xì)胞的 PBS，A組小鼠注射 不含 SW620 細(xì)胞的等量 PBS。（ 4）皮下注射法免疫治療： DC/SW620 融合疫苗 和 SW620 細(xì)胞凍融物在注射前經(jīng)過 Co-60

8、 射線 30 GY 劑量照射，以殺滅其中殘 留的腫瘤細(xì)胞。第 3 周， D 組在左、右后足底、尾根部注射含 1×107DC/SW620 融合疫苗的 PBS每部位 50 L，E 組于相同部位注射含 1×107SW620細(xì)胞凍融 物的PBS每部位 50 L第4周、第 5周D、E組重復(fù)上述治療，共 3次。 1.2.4皮下移植瘤模型的療效評(píng)估： B、C、D、E 組制模后每周測量小鼠皮下瘤 的最長徑 dmax 和最短徑 dmin，體積 V=0.52×dmin 2 ×dmax 。記錄各組小鼠的 生存期。1.2.5免疫重建效果的測定 每組每只小鼠在第 5周 7 時(shí)剪尾

9、取血 20 L/只，分離 血清，用 ELISA 方法檢測人 IgG含量。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用 SPSS10 For Windows 軟件進(jìn)行單因素方差分析。當(dāng) P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1 用腹腔注射法成功建立模擬人類免疫功能的模型應(yīng)用 ELISA方法在免疫重建后第 5 周的小鼠血清中檢測到了人 IgG，C組、D組、E組陽性均為 6/6 。但各 組之間 IgG 水平無顯著性差異（表 1）。表 1 SCID 小鼠血清中人 IgG 表達(dá)情況（ ELISA 法）分組n人 IgG 水平 g/mlA（ 假手術(shù)組 ）0/60B（ 單純制模組 ）0/60C（免疫重建組 ）6/6

10、335.91 ± 58.66D（融合疫苗治療組 ）6/6326.27 ± 48.23E（ 腫瘤細(xì)胞疫苗組 ）6/6337.07 ± 86.422.2 DC/SW620 細(xì)胞融合瘤疫苗可抑制皮下腫瘤的生長，明顯延長治療組的生存 期。2.2.1 每只建模小鼠都長出了皮下瘤（圖 1）。圖 1 DC/SW620 融合疫苗對結(jié)腸癌皮下種植瘤的影響。 （A 假手術(shù)組 B單純制模組； C 免疫 重建組； D 融合疫苗治療組； E 腫瘤細(xì)胞疫苗組）2.2.2 DC/SW620融合疫苗治療組曲線低平，提示與其他 3 組相比，此組小鼠皮 下瘤生長受到抑制。 （圖 2）圖 2 DC/S

11、W620 融合疫苗對結(jié)腸癌皮下種植瘤生長的影響。 （ B單純制模組； C 免疫重建組； D 融合疫苗治療組； E 腫瘤細(xì)胞疫苗組）2.2.3 DC/SW620 融合疫苗可明顯延長荷人結(jié)腸癌皮下種植瘤小鼠生存。融合 疫苗治療組生存期為 109.00 ± 17.17 天，明顯長于單純制模組（ 55.67 ± 12.03 ，P=0.000 ）、免疫重建組（81.83 ±9.06 ，P=0.002 ）、腫瘤細(xì)胞疫苗組（87.33 ± 12.85 ，P=0.010 ）。（表 2，圖 3）B（ 單純制模組 ）655.67 ± 12.03C（免疫重建組 ）6

12、81.83 ± 9.06P1=0.000*D（融合疫苗治療組 ）6109.00 ± 17.17P2=0.002*P3=0.010*E（ 腫瘤細(xì)胞疫苗組 ）687.33 ± 12.850.000#表 2 DC/SW620 融合疫苗對結(jié)腸癌皮下種植瘤模型生存的影響分組 n 生存期（天）P 值*與B組比較 *與 C組比較圖3 DC/SW620 融合疫苗對結(jié)腸癌皮下種植瘤模型生存的影響。* 與 E 組比較#與 B 組比較A 假手術(shù)組； B 單純建模組； C 免疫重建組； D 融合疫苗治療組； E 腫瘤細(xì)胞疫苗組）3 討論DC/結(jié)腸癌融合疫苗能有效抑制結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展本研究

13、室前期研究成功構(gòu)建了異源 DC與結(jié)腸癌細(xì)胞的融合并且成功誘導(dǎo)出 CD4T 細(xì)胞和 CD8 T反應(yīng)， CTL對結(jié)腸癌靶細(xì)胞的殺傷效力高于傳統(tǒng)的 LAK細(xì)胞疫苗和 TIL 細(xì)胞疫苗， 融合 5,8-9疫苗可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡 5,8-9 。本研究利用 DC/SW620融合疫苗治療結(jié)腸 癌皮下移植瘤模型， 取得了較理想的效果， DC/ 結(jié)腸癌細(xì)胞融合疫苗可發(fā)揮抑制 腫瘤生長， 改善預(yù)后的治療效果。 將腫瘤細(xì)胞和 DC融合，能充分發(fā)揮 DC作為抗 原提呈細(xì)胞的作用， 有效地激活抗腫瘤免疫應(yīng)答。 通過融合過程， 產(chǎn)生的融合細(xì) 胞能在 DC介導(dǎo)的共刺激作用下將廣譜的腫瘤相關(guān)抗原提呈給 T 細(xì)胞。尤為重要

14、 的是，腫瘤細(xì)胞的抗原可以作為融合細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性肽通過 MHCI 類途徑提呈， 同時(shí)也可以與 MHC 類分子結(jié)合而誘導(dǎo)出 CD4T 細(xì)胞免疫反應(yīng)。其他抗原負(fù)載DC的方式多是單一的激活 MHC I類或類分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，融合細(xì)胞獨(dú)具 同時(shí)激活 CD4T 細(xì)胞和 CD8 T細(xì)胞的能力。由此產(chǎn)生的細(xì)胞毒性反應(yīng)與輔助性 T 細(xì)胞反應(yīng)的協(xié)調(diào)作用，對于抗腫瘤免疫的有效性和可持續(xù)性至關(guān)重要 10 。DC/結(jié)腸癌融合疫苗比結(jié)腸癌細(xì)胞凍融物有更強(qiáng)的抗結(jié)腸癌細(xì)胞作用。 本研 究比較了 DC/結(jié)腸癌融合疫苗和結(jié)腸癌細(xì)胞凍融物的治療效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然 結(jié)腸癌細(xì)胞凍融物對結(jié)腸癌也能起到一定的抑制作用， 但效果都不

15、如 DC/腫瘤融 合疫苗更理想。腫瘤細(xì)胞凍融物不具備 DC的抗原提呈功能， 不能持續(xù)提供抗原， 特異性差。 DC/腫瘤細(xì)胞融合疫苗具有腫瘤細(xì)胞凍融物不具備的優(yōu)勢：融合疫苗 能自然加工抗原性腫瘤蛋白， 并以 MHC-I 類復(fù)合體的形式提呈到細(xì)胞表面； 融合 疫苗能促進(jìn) DC的功能，能為 MHC-I 類復(fù)合體的提呈提供連續(xù)的內(nèi)源性腫瘤抗原 11-12。近年來，應(yīng)用 DC/腫瘤細(xì)胞融合疫苗治療惡性腫瘤， 被廣泛研究并部分應(yīng)用 于臨床治療，取得了一些成績， 但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些問題： 目前通用的體外誘導(dǎo) 和培養(yǎng) DC的方法耗時(shí)、費(fèi)力、價(jià)格昂貴，不能規(guī)?；a(chǎn)，且易被污染，尚不 能廣泛應(yīng)用于臨床。相信隨研

16、究的深入， DC/結(jié)腸癌細(xì)胞融合疫苗有望成為治療 結(jié)腸癌的新有效途徑。參考文獻(xiàn)1 Feng Xu,Ying-JY, Wei Liu, et al. against colorectal cancer liver metastasis in SCID miceJ.Scandinavian Journal of Gastroenterology June, 2010, 45(6): 707-713.2 Ahmedin J, Rebecca S, Elizabeth W,e t al. Cancer Statistics 2008. J Cancer Clin,2008,58:7196.3 Haen

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