酶的抑制劑及激活劑

1、酶的抑制劑與激活劑授課教師: 余子全研 究 生: 賈亮 何戀一.目的與內(nèi)容 目的：學習研究酶的抑制劑和激活劑的方法，并通過幾種金屬離子和表面活性劑對枯草桿菌堿性蛋白酶活力的影響，篩選出該酶的某些抑制劑和激活劑。 內(nèi)容：1.幾種金屬離子Ca2+、Ag+、Cu2+、Hg2+和Mg2+對枯草桿菌堿性蛋白酶活力的影響；2.洗衣粉對枯草桿菌堿性蛋白酶活力的影響。二.基本原理 酶分子與配體結合后，可以改變酶的活性。使酶活性降低乃至完全喪失活性的配體，稱為酶的抑制劑；能啟動和（或）增強酶的活性，稱為酶的激活劑。研究酶的抑制和激活作用，具有重要的實用價值。 抑制劑或激活劑的作用部位，主要是酶的活性中心的必要基

2、團或直接影響酶的結構殘基所引起的效應。 本實驗所用的是枯草桿菌堿性蛋白酶，該酶是由地衣芽孢桿菌經(jīng)深層發(fā)酵提煉所得，能將大分子蛋白質水解成游離的氨基酸等產(chǎn)物，最適pH值一般為9-11，最適溫度為40-50。 Folin-酚法測堿性蛋白酶酶活原理 Folin-酚試劑在堿性條件下，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍色反應(鉬藍和鎢藍的混合物)。 在一定濃度范圍內(nèi)，藍色深淺與含酚羥基氨基酸 (酪氨酸)的量成正比，通過比較加入金屬離子(或洗衣粉)后和未加入金屬離子(或洗衣粉)的反應酶液的OD680值，可以推斷出該種金屬離子是該酶的激活劑還是抑制劑。 三.器材和用具1.恒溫水浴鍋，試管，722紫

3、外可見分光光度計，移液槍，EP管，試管架。2.試劑：20mM/L氯化鈣， 20mM/L硝酸銀， 20mM/L硫酸銅， 20mM/L氯化汞， 20mM/L氯化鎂，0.6洗衣粉， 0.4 mol/L 碳酸鈉， 2酪蛋白，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(稀釋2000倍)，福林-酚(市售福林-酚試劑加水稀釋1倍，約為1 mol/L )， 0.5M/L氫氧化鈉，pH10硼砂緩沖液，pH7磷酸緩沖液， 10% TCA。四四. .操作步驟操作步驟1金屬離子對酶活力的影響：金屬離子對酶活力的影響：(1)分別將1ml pH 10.0酶液與相應體積的氯化鈣、硝酸銀、硫酸銅、氯化汞、氯化鎂溶液混合，使反應液中金屬離子終濃度

4、分別為0.8 mmol/L和0.4mmol/L。(2)混合液及pH10原酶液、 pH10空白(共12支)25放置20 min。(3)將混合液預熱至40，加入預熱的2%酪蛋白溶液1 ml，于40反應10 min。(4)反應結束時加入10%三氯醋酸溶液2 ml(終止反應) ，立即搖勻，靜置10 min。(5)各取上清1.5ml于EP管中，6000rpm,離心1min 。取上清1ml于試管中，各加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5ml及福林一酚試劑1 ml，置于40顯色15 min 。(6)測定OD680值 ，并以原酶活力為100，算出相對酶活?？瞻自囼灂r，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和底物，

5、同樣測定OD680值。 2洗衣粉對酶活力的影響：洗衣粉對酶活力的影響：(1)分別在pH 7.0和pH 10.0酶液中加入洗衣粉(反應液終濃度為0.03%)。(2)混合液和pH7原酶液、 pH7空白(共4支)于25下放置20 min。(3)測酶活力，并以原酶活力為100，算出相對酶活。五.注意事項1.實驗中，以先加TCA的酶液為空白，以原酶液試管為 標準液，對其操作應與實驗試管同步一致。2.由于分光光度計比較精密，所以往試管中加藥品的 時候要盡量做到準確。3.拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接觸它的光滑 面；擦拭比色皿要順著一個方向擦。4.在比色皿中裝入的液體量大約是比色皿體積的三分之二。六.實驗報告 將實驗結果填入下表中。 表1 金屬離子對酶活力的影響金屬離子剩余活力相對活力Ca2+0.8 mmol/L 1000.4mmol/L 100Ag+0.8 mmol/L 1000.4 mmol/L 100 Cu2+0.8 mmol/L 1000.4mmol/L 100Hg2+0.8 mmol/L 1000.4 mmol/L 100Mg2+0.8 mmol/L 1000.4 mmol/L 100表2 洗衣粉對酶活力的影響 剩余酶活 相對酶活標準pH7.0 酶 100pH10.0 酶 100洗衣粉pH7.0酶 100pH10.0 酶 100八.問題與思考 1