人血漿中穿心蓮內(nèi)酯的HPLCMS測定及生物等效性研究

1、人血漿中穿心蓮內(nèi)酯的HPLCMS測定及生物等效性研究         09-08-24 15:03:00     編輯：studa20                作者：張志華，何周康，周彥彬，厲宇紅，田娟，左英，丁勁松【摘要】  目的：建立人血漿中的穿心蓮內(nèi)酯的HPLCMS測定法，研究兩種穿心蓮內(nèi)酯分散片的相對生物

2、利用度。方法：血漿樣品液液萃取后，進行LCMS分析，色譜柱為漢邦C18柱（4.6 mm× 150 mm，5 m），流動相為甲醇水（7228，v/v），檢測離子為m/z 373. 6（穿心蓮內(nèi)酯）、m/z 267.7（奈韋拉平，內(nèi)標）。20名健康志愿者采用隨機交叉方式分別單次口服穿心蓮內(nèi)酯分散片T或R各0.15 g，在不同時間點取血，樣品以新建立的HPLCMS法測定，研究比較兩制劑的藥動學(xué)參數(shù)及相對生物利用度。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯在1.343268.6 g/L濃度范圍內(nèi)與峰面積比線性良好，最低定量濃度為1.343 g/L。方法回收率為95.7%104.7%，日內(nèi)RSD小于6.4%，日間RS

3、D小于12.4%。單劑量口服穿心蓮內(nèi)酯分散片T和R 0.15 g后兩種制劑的Cmax 為（114.26±37.20）g/L、（107.95±32.44）g/L、；Tmax為（1.0±0.3）h、（1.1±0.3）h；AUC036 為（375.96±89.86）g·h/L、（368.84±89.14）g·h/L；AUC0為（388.39±91.14）g·h/L、（382.81±97.14）g·h/L；T1/2為（7.65±2.24）h、（7.90±2.16）

4、h。結(jié)論：該方法選擇性好，靈敏度高，可用于穿心蓮內(nèi)酯的體內(nèi)過程研究。藥動學(xué)參數(shù)經(jīng)方差分析表明，穿心蓮內(nèi)酯分散片T和R中穿心蓮內(nèi)酯的主要藥動學(xué)參數(shù)之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，雙單側(cè)t檢驗結(jié)果表明兩制劑為生物等效制劑。 【關(guān)鍵詞】  穿心蓮內(nèi)酯；HPLCMS法；生物利用度；生物等效性AbstractObjective: To develop an HPLCMS method to determine andrographolide in plasma and evaluate the bioavailability of andrographolide dispersible tablets

5、. Methods: Sample preparation was based on liquidliquid extraction. The compounds were separated on a Hanbon C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 m) with mobile phase of methanolwater (7228, v/v) and analyzed by MS detector. Nevirapine was the internal standard and the target ions were m/z 373.6 for an

6、drographolide and m/z 267.7 for the internal standard. In a randomized crossover design, 20 healthy male volunteers were given 0.15 g andrographolide dispersible tablets T (test drug) or R (reference drug). The plasma samples were obtained and determined by the newlydeveloped HPLCMS method and the p

7、harmacokinetics and bioavailability were studied. Results: The calibration curve of andrographolide were liner within the range of 1.343268.6 g· L-1 with the limit of quantity 1.343 g·L-1, the methodology recoveries were in the range of 95.7%104.7%. Interday and intraday RSDs were less tha

8、n 6.4% and 12.4%, respectively. Pharmacokinetic parameters of andrographolide after a single dose of T and R were as following: Cmax were (114.26±37.20) g·L-1 and (107.95±32.44) g·L-1; Tmax were (1.0±0.3) h and (1.1±0.3) h; AUC0 36 were (375.96±89.86) g·h·

9、;L-1 and (368.84±89.14) g·h·L-1; AUC0  were (388.39±91.14) g·h·L-1 and (382.81±97.14) g ·h· L-1; t1/2 were (7.65±2.24) h and (7.90±2.16) h. Conclusions: The method is selective, sensitive and rapid for andrographolide determination. The res

10、ults of ANOVA analysis and two oneside t tests show that there is no significant difference between the pharmacokinetic parameters of the two formulations and bioequivalence is observed.Key wordsAndrographolide; HPLCMS; Bioavailability; Bioequivalence穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide）是從中草藥穿心蓮中提取的純中藥的有效單體，為穿心蓮的主

11、要活性成分之一，在穿心蓮中含量較高，且毒性最低1，是臨床上應(yīng)用有效的清熱解毒、抗菌消炎藥。但由于穿心蓮內(nèi)酯的水不溶性，單體穿心蓮內(nèi)酯較提取物在體內(nèi)吸收差，血藥濃度達不到治療濃度而導(dǎo)致臨床療效不穩(wěn)定，故將其加工為分散片以加大溶解度和溶出速率2。國內(nèi)多采用HPLC法測定動物體內(nèi)的穿心蓮內(nèi)酯的血藥濃度36。由于儀器靈敏度的限制，難以滿足該制劑在人體內(nèi)的完整藥時曲線的測定與藥物動力學(xué)研究。本文采用HPLCMS聯(lián)用技術(shù)，建立了簡便、靈敏的體內(nèi)分析方法，為穿心蓮內(nèi)酯的人體藥代動力學(xué)研究提供可靠的檢測手段，并以此法研究了兩種穿心蓮內(nèi)酯分散片的相對生物利用度。1  實驗部分1.1  儀器與

12、試劑    Waters ZQ2000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（含二元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、2695液相色譜儀）；Masslynx 4.0高級色譜工作站；美國Millipore超純水儀；METTLER電子天平；AllegraTM 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機（BECKMAN COULTERTM）；旋渦混合器（上海分析儀器廠）。    穿心蓮內(nèi)酯對照品（天津市漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司提供，含量99.6%）；奈韋拉平（內(nèi)標，南京第一醫(yī)院提供）；穿心蓮內(nèi)酯分散片R（50 mg/片，江西青峰藥業(yè)有限公司，批

13、號20050711）。穿心蓮內(nèi)酯分散片T（50 mg/片，天津市漢康醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司試制，批號050324）。甲醇（色譜純，TEDIA Company）；水為純化水；其它試劑均為國產(chǎn)分析純（AR級）。1.2 色譜條件及血樣處理漢邦C18柱（4.6 mm×150 mm, 5 m）；柱溫：25 ；流動相： 甲醇水（7228，v/v）；流速：1.0 mL/min分流進樣。毛細管電壓：3.50 KV；錐孔電壓：35 V；干燥氣流速：500 L/h；離子源溫度：120 ；輔助氣溫度：380 ；離子檢測方式：選擇性離子檢測（SIM）；離子極性：正離子（positive）；離子化方式：氣動輔助

14、電噴霧離子化（ESI）；檢測對象：穿心蓮內(nèi)酯，M+Na+，m/z 373.6；內(nèi)標：奈韋拉平，M+H+，m/z 267.7。準確吸取血漿0.5 mL，置10 mL具塞尖底離心管中，加入內(nèi)標（1.068 g/mL）100 L，漩渦振蕩1 min，加入乙酸乙酯2.5 mL，漩渦振蕩3 min，4 000 r/min離心10 min，吸取有機相于另一離心管中，50 水浴氮氣吹干。殘渣用150 L流動相溶解，進樣20 L。1.3 試驗方案    試驗經(jīng)中南大學(xué)倫理委員會批準，20名健康男性志愿者，年齡（22.2±1.4）歲，體重（58.5±5.7）kg，經(jīng)簽署知情同意書和體檢合格后納入試驗。志愿者隨機等分為兩組，禁食12 h后，于清晨分別單次口服穿心蓮內(nèi)酯片T或R 0.15 g，于服藥前及服藥后0.25 h、0.5 h、0.75 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h，8.0