中藥對常見革蘭陰性桿菌耐藥菌株體外抑菌試驗觀察

1、中藥對常見革蘭陰性桿菌耐藥菌株體外抑菌試驗觀察        【摘要】     目的 探討中藥對常見多重耐藥革蘭陰性桿菌治療的可行途徑。 方法 用自制中藥液對多重耐藥的銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌采取試管內(nèi)藥液稀釋法和紙片法進(jìn)行藥物敏感試驗。 結(jié)果 中藥液對全銅綠假單胞菌以及多重耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌作用較大，對多重耐藥菌鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌作用較弱。 結(jié)論 由于中草藥的多作用機(jī)制，一般

2、在臨床不易形成耐藥，但中草藥目前的炮制和使用情況下難以達(dá)到如此高的體內(nèi)濃度，難以替代抗生素，應(yīng)在中草藥和抗生素聯(lián)合使用上進(jìn)一步研究，以減少耐藥性和抗生素殘留。     【關(guān)鍵詞】  中藥 革蘭陰性桿菌 多重耐藥    Observation on the effect of traditional Chinese medicine on multi-drug resistant strains of gram-negative rods.WANG Zhi-wei, PANG Xue-yun, XIAN Z

3、hong-ren, et al.(Laboratory Department of  Gangwan Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510700, Guangdong, P. R. China)    Abstract：Objective  To observe the effect of traditional Chinese medicine in dealing with multi-drug resistant strains of gram negative baci

4、llus.  Methods  The susceptibility of organisms identified by automatic microbial system(Vitek) was tested by Kirby-Bauer(K-B) method as described in NCCLS to ensure their multi-drug resistance. The methods of dilution test in tubes and testing sensibility in the agar plate with drug paper

5、 were selected to determine the effect of extract of traditional Chinese medicine against the multi-drug resistant strains of Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae.  Results  Both methods showed that the t

6、raditional Chinese medicine was more effective on the strains of Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia, and less effect for the strains of Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae.  Conclusion  The multiple acting mechanhisms of traditional Chi

7、nese medicine on bacteria is less likely to lead to the occurrence of drug resistance in microoganisms. But to date traditional  Chinese medicine is not easy to reach a high concentration in vivo, thus it can not replace antibiotics. Therefore combined use of traditional Chinese medicine and an

8、tibiotics is recommended.    Key words：Traditional Chinese medicine;  Gram negative bacillus;  Multi-drug resistant strains隨著臨床治療手段快速發(fā)展，抗生素藥物廣泛及不合理的使用，帶來的負(fù)面效應(yīng)是醫(yī)院感染率上升和耐藥菌株的增加。多重耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致臨床治療失敗，感染復(fù)發(fā)，死亡率增高等。目前，多重耐藥的假單胞菌、不動桿菌以及產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰酶（ESBLs）腸桿菌科細(xì)菌已成為一些大型綜合醫(yī)院常見的醫(yī)院感染菌，如何應(yīng)對這些耐藥細(xì)

9、菌，已成為醫(yī)院各級醫(yī)護(hù)人員必須面對的嚴(yán)峻問題。本試驗采用部分中藥提取液對臨床分離的常見多重耐藥革蘭陰性桿菌進(jìn)行中藥抑菌試驗。借此了解中草藥制劑抑菌作用以及探索對多重耐藥革蘭陰性桿菌的中藥治療途徑。1  材料與方法11  材料111  菌種  質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922，多重耐藥菌株為銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌，由廣東省中醫(yī)院檢驗科從臨床標(biāo)本分離，并經(jīng)VITEK32細(xì)菌全自動系統(tǒng)和手工鑒定為多重耐藥菌株。多重耐藥菌株常用抗生素敏感試驗見表1。112  培養(yǎng)基及肉湯  M

10、-H平板及肉湯管均購自迪景微生物科技有限公司。表1  常見革蘭陰性桿菌抗生素藥敏試驗（略）注：AN:丁胺卡那霉素 AM:氨芐西林 AMS:氨芐西林/舒巴坦蕩 CZ:頭孢唑啉FEP:馬斯平均CRO:頭孢曲松 CIP:環(huán)丙沙星 GM:慶大霉素 IMP:亞胺培南 FD:呋喃妥因 TZP:派拉西林/他唑巴坦 TOB:妥布霉素 SXT:復(fù)方新諾明 LEV:左旋氧氟沙星 SCF:頭孢哌酮/舒巴坦。113  藥物及藥液制備  復(fù)方由黃連、制黃芪、茵陳、訶子、甘草、肉桂等中藥組成。茵陳及肉桂先以水蒸氣蒸餾法制備得揮發(fā)油，藥渣再以水提醇沉法制備。黃連、制黃芪、訶子、甘草水提醇沉法制

11、備，上三種藥液混合，文火半小時除去殘留乙醇。兌以蒸餾水，即成含藥物濃度為100%（1ml溶液含1g生藥）的藥液86ml，高壓滅菌備用。 114  供藥敏用紙片制備  將普通定性濾紙用打孔機(jī)打成若干圓形紙片，直徑為6mm，置于干燥潔凈的試管內(nèi)，放入高壓蒸氣滅菌器中，經(jīng)121.3 1520min高壓滅菌后，取出，放入干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥備用。1 2  方法121  試管內(nèi)藥液稀釋法（二倍稀釋法）測定抑菌效價  取帶塞無菌試管7組，每組8支排列在管架上，于每組第1管加入無菌藥液2.0ml，第2管起加入無菌肉湯培養(yǎng)基2.0ml，然后于每組第2管中

12、加入滅菌的受試中藥液2.0ml，混勻后取出2.0ml放入第3管中，依此類推，直到第6管取出2.0ml棄去，使成1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32濃度。第7管不加藥液作為對照，以便觀察培養(yǎng)基是否適合細(xì)菌生長。第8管中加入受試中藥液2.0ml，混勻取出2.0ml棄去，不加細(xì)菌，以便觀察受試藥液是否有污染。將用肉湯培養(yǎng)68h的 質(zhì)控及多重耐藥菌菌液，用無菌肉湯稀釋成10-3濃度，分組加0.1ml至上述17管中?；靹蚝螅湃?7孵箱中培養(yǎng)1624h后觀察結(jié)果。將培養(yǎng)后清亮管轉(zhuǎn)種到M-H平板上，仍無細(xì)菌生長，即表示該管藥量是受試中藥液的最低殺菌濃度，記錄結(jié)果。122  菌株對中藥液

13、的敏感性試驗紙片法  將已高壓蒸氣滅菌的干燥備用紙片無菌操作放置已均勻涂布菌液的M-H平板中，每種菌貼三組紙片，每組分別加0.02ml、 0.04ml、 0.06ml藥液于紙片上然后將平板置37溫箱中培養(yǎng)24h后測量抑菌圈的大小，記錄結(jié)果。2  結(jié)果21  試管內(nèi)藥液稀釋法（二倍稀釋法）測定結(jié)果  實(shí)驗結(jié)果顯示，藥液原液對所試驗菌株均有抑菌作用，未見細(xì)菌生長。鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、肺炎克雷伯菌、質(zhì)控大腸埃希菌、質(zhì)控銅綠假單胞菌的MIC分別為1：4、1：2、1：4、1：8、1：2、1：2、和1：4。中藥液對嗜麥

14、芽窄食單胞菌作用較大，最低殺菌濃度達(dá)到1:8，對大腸埃希菌作用較弱，最低抑菌濃度為1:2，且與是否產(chǎn)超廣譜-內(nèi)酰酶（ESBLs）無關(guān)。22  菌株對中藥液的敏感性試驗紙片法  從實(shí)驗結(jié)果可以看到，三個濃度的藥液對多重耐藥菌鮑曼復(fù)合醋酸鈣不動桿菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌以及質(zhì)控大腸埃希菌沒作用，但對質(zhì)控銅綠假單胞菌、全耐藥的銅綠假單胞菌以及多重耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌均有作用，而且0.06ml濃度藥液對后兩者有強(qiáng)抑制作用。見表2表2  中藥液對多重耐藥菌及質(zhì)控菌的抑菌圈直徑（mm）及抑菌作用（略）注：凡抑菌圈直徑大于10.0mm者為強(qiáng)抑菌，用“+”表示；抑圈直徑為8

15、.010.0者為抑菌，用“+”表示；抑菌圈直徑小于6.08.0mm者為弱抑菌，用“+”表示；沒抑菌作用用“-”表示3  討論    近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥率日趨上升和多重耐藥性更加嚴(yán)重，給臨床防治帶來極大困難。中醫(yī)藥傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上常用作機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，但作為一種新的抗菌藥物逐漸受到重視，其作用機(jī)理是多方面的，既能干擾細(xì)胞壁合成、損傷胞漿膜，也有影響細(xì)胞蛋白合成、影響核酸合成干擾遺傳密碼復(fù)制的作用1。而且其劑型方便、毒副作用小逐漸應(yīng)用到臨床抗菌治療中。許多中藥具有抑菌或殺菌作用，其抑菌作用機(jī)理主要以下幾方面：中藥有效成分的作用；與其它藥物的協(xié)同

16、作用，藥物的配伍影響等2。本實(shí)驗采用黃連、制黃芪、茵陳、訶子、甘草、肉桂等中藥配伍制得藥液，從MIC實(shí)驗結(jié)果可以看出，其藥液原液對試驗的幾種多重耐藥菌均有抑制作用，但紙片法中三種濃度對腸桿菌屬三個菌均無抑菌作用。這可能與復(fù)方制劑含多個單味藥，具有多種有效成分，其分子大小不同，在瓊脂中的滲透性有差異，從而也影響了復(fù)方的抗菌效果有關(guān)3。所以體外測藥物抗菌效力太小，連續(xù)稀釋法較為常用。    據(jù)報道雖然磺胺類、抗生素對許多菌種療效逐年下降，但耐抗生素的細(xì)菌對植物中的抗菌物質(zhì)仍多敏感，這可能與中藥的多作用機(jī)制，一般在臨床不易形成耐藥有關(guān)。如三黃湯中黃連、黃柏、大黃、甘草分

17、別作用于細(xì)菌代謝不同環(huán)節(jié)，可使其不易產(chǎn)生耐藥4。本實(shí)驗中藥提取液對多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌、全耐藥銅綠假單胞菌均有較強(qiáng)作用也證實(shí)這一點(diǎn)。但復(fù)方體外抗菌試驗具有抑菌作用只是初步說明藥物單純的抗菌作用，不足以闡明藥物對整個機(jī)體的影響，其抗菌作用還需進(jìn)行體內(nèi)的抗菌實(shí)驗和最終的臨床驗證。而且中草藥的抑菌濃度是抗生素的1 000倍級，這在中草藥目前的炮制和使用情況下難以達(dá)到如此高的體內(nèi)濃度，單味中草藥難以替代抗生素，應(yīng)在中草藥和抗生素聯(lián)合使用上進(jìn)一步研究，以減少耐藥性和抗生素殘留5。    【參考文獻(xiàn)】  1 周小梅, 莫其農(nóng), 李忠新. 中草藥抗金黃色葡萄球菌研究進(jìn)展J.