銀杏葉提取黃酮及分離純化

1、銀杏葉提取黃酮及分離純化組員：李佳輝、黃埔、趙超武一、 實驗目的1.掌握傳統(tǒng)的溶劑提取法并對銀杏中的黃酮進行提取2.掌握紫外分光光度計的應用，以及相關溶液的配置3.學會自主設計實驗，培養(yǎng)團隊合作精神二、實驗原理關于黃酮：銀杏中最具藥用價值的成分，有提高人體免疫力的作用；并且抗衰老、調節(jié)內分泌，還具有抗炎、抗真菌的作用；實驗需設置空白參比液，由文獻資料可知蘆丁標準液的最大波長大概為510nm;本實驗采用硝酸鋁（氯化鋁）法測定銀杏葉總黃酮的質量濃度，因為黃酮類化合物可以與鋁鹽發(fā)生絡合顯色反應。其主要原理為：在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在的條件下，黃酮類化合物與鋁鹽發(fā)生螯合反應，加入氫氧化鈉溶液后，溶

2、液顯橙紅色，在510nm（左右）處有吸收峰，且符合定量分析的朗伯比爾定律（即A=kbc）一般與蘆丁標準溶液比較定量。先用亞硝酸鈉還原黃酮類化合物，再加鋁鹽絡合，最后加氫氧化鈉溶液使黃酮類化合物開環(huán)，生成2-羥基查爾酮而顯色。顯色原理發(fā)生在黃酮醇類鄰位無取代的鄰二酚羥基部位，不具有鄰位無取代的鄰二酚羥基的黃酮類成分加入上述試劑時是不顯色的。（如二氫黃酮類化合物就不發(fā)生該顯色反應）目前銀杏葉黃酮的提取方法主要有：溶劑提取法、超臨界流體萃取法（SFE法）、高速逆流色譜技術提取法（HSCCC微波提取法、超色波提取法、酶提取法、分子烙印技術。因溶劑提取法操作簡單，所需試劑廉價易得，故通常使用此法來進行大

3、規(guī)模生產(chǎn)。其工藝流程如下：銀杏葉粉碎NaOH-60%乙醇回流提取離心過濾濾液收集二次醇提合并兩次濾液樹脂吸附脫吸濃縮干燥提取物由于銀杏葉黃酮中的類黃酮主要為蘆丁，故用蘆丁為對照物繪制標準曲線，并采用分光光度法進行測定。三實驗材料及器材1. 材料酸銀杏葉、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95乙醇、磷酸氫二鈉、磷二氫鈉、D101大孔吸附樹脂、鹽酸2. 相關溶液的配制和樹脂預處理0.20mgmL蘆丁標準溶液（500mL）、5NaNO2（500mL）、10AI(NO33（500mL）、1molLNaOH 、0.4molLNaOH（500mL）、0.4molL HCl(500mL、30%乙醇（500m

4、L）30%乙醇（1）D101樹脂預處理(500g：商品樹脂均殘留惰性溶劑，故使用前根據(jù)應用需要，必須進行不同深度的預處理，在提取器內，加入高于樹脂層10-20厘米的乙醇浸泡34小時，然后放凈洗滌液，為一次提取過程。用同樣方法反復洗至出口洗滌液在試管中加3倍量水不顯渾濁為止，后用清水充分淋洗至無明顯乙醇氣味，即可進行一般使用。（2）蘆丁標準溶液：精密稱取在105常壓干燥至恒重的蘆丁對照品20mg，置于100 mL容量瓶中，加30乙醇約30mL，置水浴微熱使之溶解，放冷，加30乙醇稀釋至刻度，搖勻得蘆丁標準溶液（0.20mg/mL）（3）、5% NaNO2的配制：準確稱取5g NaNO2加入到95

5、g蒸餾水中溶解。 （4）、10% AI(NO33的配制： 準確稱取10g AI(NO33加入到90g蒸餾水中溶解。（5）、1mol/L NaOH的配制：稱取5g NaOH 于一定量蒸餾水中溶解，再定容至100mL。（6）、0.4mol/L NaOH 的配制：稱取1.6gNaOH 于一定量蒸餾水中溶解，再定容至100mL。(7、0.4mol/L HCl的配制：取4ml的36.5%的HCl溶于100ml蒸餾水中3.儀器紫外可見光分光光度計、干燥箱、旋轉蒸發(fā)儀、離心機、回流裝置、恒溫水浴鍋、中藥粉碎機、容量瓶四

6、、實驗步驟1.原料準備：稱取200g銀杏葉洗凈，于80下干燥，干燥后于中藥粉碎機中粉碎，備用。2.黃酮的提取(銀杏葉每組10g(1一次醇提：準確稱取銀杏葉粉末10g，放入索是氏提取器中，用濃度為60%乙醇溶液按1:8（g/ml）混合均勻，在80下回流1.5h，(2離心：在3500r/min下離心10min；(3過濾：真空抽率，濾液收集；(4二次醇提：濾渣用濃度為60%乙醇溶液按1:8（g/ml混合均勻,進行二次醇提，方法同上(5合并兩次濾液，將濾液置于100ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀釋至刻度3.黃酮的純化層析柱制備：(1 準備：D101大孔吸附樹脂預處理并充分吸漲(2 濕法裝柱：將吸漲

7、后的樹脂與溶劑的混合物倒入色譜柱中，讓其自行沉積。(50ml(3 上樣：將樣品溶液從柱的上端以較快速度加入(4 洗脫：待樣品完全上柱后，用30%乙醇進行洗脫，并在下端收集洗脫液。(5 濃縮：將洗脫下來的樣品進行濃縮(6 干燥(7得到產(chǎn)品(8樣品濃度測定操作方法：3.1裝柱將D101大孔吸附樹脂用丙酮浸泡過夜（大約15-18h），用水浴回流8h,過濾（或抽濾），用水洗至溶液：水（1:2）不產(chǎn)生混濁為止，浸泡在水中，再進行裝柱，并在柱頂加少量氧化鋁，制成預處理柱，備用。3.2樣品預處理精密吸取樣品5ml(固體樣品制成相當濃度的溶液，加入已處理好的D101大孔樹脂層析柱中，用100ml水洗脫（含蔗糖

8、樣品用300ml水），洗液棄去（流速1.5ml/min。再以原流速用30ml無水乙醇分次洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用無水乙醇溶解，定量轉移至5ml容量瓶中，稀釋至刻度，作為供試品溶液。4.黃酮含量的測定（1）標準曲線繪制精密量取0.2mg/ml蘆丁標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10.0 mL容量瓶中，各加30乙醇至5mL，加5亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻；放置6min，加10硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻；再放置6 min，加4氫氧化鈉溶液2mL，加30乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以第1管作空白對照，在波長510nm處測各試管中溶液的吸光度（1號做空白），以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制出標準曲線，并得到回歸方程。葡聚糖標準曲線的測定結果編號 1 2 3 4 5 6蘆丁濃度（mg/ml）吸光值（A510nm）(2樣品含量的測定，加30乙醇至5mL，加5亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻；放置6min，加10硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻