尼氟滅酸對肝癌細(xì)胞增殖的影響

1、Received 2002207201Accepted 2002211207This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No 130270602 and the Foundation for University K ey Teachersby the Ministry of Education of China.3Corresponding author. Tel :+8622923374519; Fax :+8622923246270; E 2mail :sszhou fmmu 1

2、edu 1cn研究論文尼氟滅酸對肝癌細(xì)胞增殖的影響田晶1, 陶凌1, 曹云新2, 董玲1, 胡玉珍1, 楊安鋼3, 周士勝1, 31第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室、2免疫學(xué)教研室、3生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室, 西安710032摘要:為了觀察氯通道阻斷劑尼氟滅酸(NFA 對人肝癌細(xì)胞(human hepatoma cell line , HHCC 增殖的影響, 我們將NFA 作用于HHCC , 應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)法及噻唑蘭(M TT 比色分析法觀察細(xì)胞增殖情況; 用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時(shí)相; 并用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測Ca 2+i 的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn), NFA 使HHCC 細(xì)胞數(shù)及M TT 光吸收值(O

3、D 較對照組都顯著降低, 去除NFA 后, OD 值逐漸恢復(fù)。經(jīng)100mol/L NFA 處理48h 的HHCC 細(xì)胞G 1期細(xì)胞比例比對照組明顯增高, S 期及G 2期細(xì)胞比例明顯低于對照組。細(xì)胞外應(yīng)用NFA (100mol/L 使Ca 2+i 快速降低, 去除NFA 后, Ca 2+i 可恢復(fù)。這些結(jié)果表明, 尼氟滅酸能抑制細(xì)胞增殖, 其機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Ca 2+/CaM 途徑被抑制有關(guān)。關(guān)鍵詞:肝癌; 增殖; 氯通道; 鈣中圖分類號:Q253; R73517E ffects of niflumic acid on the proliferation of human hepato

4、ma cellsTIAN Jing 1, TAO Ling 1, CAO Yun 2Xin 2, DON G Ling 1, HU Yu 2Zhen 1, YAN G An 2G ang 2, ZHOU Shi 2Sheng 1, 3Depart ments of 1Physiology , 2Im m unology , and 3B iochem ist ry and Molecular B iology , the Fourth M ilitary Medical U niversity , Xi an 710032Abstract :The purpose of this work w

5、as to investigate the effects of niflumic acid (N FA , a chloride channel blocker , on the proliferation of human hepatoma cell line (HHCC . Cell proliferation was ana 2lyzed by cell count and M TT assay. Cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. Ca 2+i was determined by laser scanning

6、confocal system. It was found that N FA decreased significantly the cell number and the M TT optical density (OD of HHCC cells , and that the OD value was reversed after washout of N FA. Compared with control , N FA blocked cell cycle progression in G 1phase. Extracellular application of N FA (100mo

7、l/L induced a rapid decrease in Ca 2+i . These findings demonstrate that blockage of chloride channels by N FA induces growth arrest of HHCC in G 1phase , which may be due to the inhibition of Ca 2+/CaM 2dependent signaling pathways. K ey w ords :hepatoma ; proliferation ; chloride channel ; Ca 2+哺乳

8、動(dòng)物細(xì)胞膜上有多種類型離子通道, 研究發(fā)現(xiàn)這些離子通道除了與細(xì)胞電活動(dòng)有關(guān)外, 還與細(xì)胞的增殖1,2、分化3和凋亡4有密切關(guān)系。氯通道是細(xì)胞膜上介導(dǎo)陰離子跨膜運(yùn)動(dòng)的一個(gè)通道蛋白家族。最近發(fā)現(xiàn)氯通道在細(xì)胞增殖中起重要作用。Wondergem 等報(bào)道氯通道阻斷劑DIDS 、N PPB 、ta 2moxifen 、mibefradil 通過影響容量敏感性氯電流抑制肝AML12細(xì)胞的增殖5。而氯通道在腫瘤細(xì)胞增61生理學(xué)報(bào)A cta Physiologica S i nica , April 25, 2003, 55(2 :160-164殖活動(dòng)中的作用還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察氯通道阻斷劑尼氟滅酸(N

9、FA 對人肝癌細(xì)胞(human hep 2atoma cell line , HHCC 增殖的影響, 分析氯通道在癌細(xì)胞增殖中的作用機(jī)制, 探討通過抑制氯通道達(dá)到控制腫瘤生長的可能性。1材料和方法111材料HHCC 由本校細(xì)胞工程中心陳志南教授饋贈(zèng)。N FA 、噻唑蘭(M TT 、胰蛋白酶、ED TA 、HEPES 購自Sigma 。DM EM 購自GIBCO 。112方法11211主要藥物配制N FA :用二甲基亞砜(DM 2SO 配成011mol/L 的原液, 4保存, 實(shí)驗(yàn)前用DM EM 或臺(tái)氏液稀釋成工作液。DM EM 培養(yǎng)基:按說明書配制, 用1mol/L 的HEPES 調(diào)p H 至

10、712-714, 過濾分裝, 4保存?zhèn)溆谩 TT 溶液:用生理鹽水配制, 濃度為5g/L , 0122m 微孔濾器過濾除菌后, 4保存?zhèn)溆?。臺(tái)氏液成分為(mmol/L :NaCl 143、KCl 514、MgCl 2015、CaCl 2118、NaH 2PO 4013、G lucose 5和HEPES 2NaOH 5。11212細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DM EM 培養(yǎng)基(正常培養(yǎng)液 中, 置于CO 2孵箱中,在37、5%CO 2條件下培養(yǎng)。每2d 換液1次, 3-4d 傳代1次。11213細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察細(xì)胞增殖細(xì)胞懸液以3×104-4×104每孔的密度接種于2

11、4孔板, 培養(yǎng)12h 后, 吸去培養(yǎng)液, 隨機(jī)分組(n =3 , 加入正常培養(yǎng)液(對照 或含不同濃度N FA 的培養(yǎng)液, 培養(yǎng)2d 后, 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù), 以時(shí)間為橫軸、細(xì)胞數(shù)為縱軸做量效曲線。11214MTT 比色分析法觀察細(xì)胞增殖按照文獻(xiàn)6報(bào)道方法, 細(xì)胞懸液以每孔3×104-4×104的密度接種于24孔板, 培養(yǎng)12h 后, 隨機(jī)分組(n =4 , 吸去培養(yǎng)液, 加入正常培養(yǎng)液(對照 或含有NFA 50mol/L 或含有NFA 100mol/L 的培養(yǎng)液。每天同一時(shí)間, 在每組的隨機(jī)4個(gè)孔中加入80l MTT (5g/L , 并于4h 后小心吸去上清液, 加入20

12、0l DMSO 溶解結(jié)晶體。3d 后, 溶液移入96孔板, 用酶聯(lián)免疫測定儀(Model 550, Bio 2Rad , USA 讀取490nm 光吸收值。以往的研究表明, 用M TT 比色分析法, OD 值與細(xì)胞數(shù)成正比, 可以反映細(xì)胞的數(shù)量6。11215細(xì)胞周期分析將HHCC 細(xì)胞懸液接種于3個(gè)25ml 培養(yǎng)瓶中, 每瓶約1×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后, 采用常用的血清饑餓法, 使細(xì)胞同步化。即:在實(shí)驗(yàn)開始前, 先給予無血清培養(yǎng)液處理細(xì)胞24h , 使細(xì)胞周期停滯在G 0期, 然后給細(xì)胞換液, 并隨機(jī)加入正常培養(yǎng)液(對照組 、含DMSO 的培養(yǎng)液及含有100mol/L N FA 的

13、培養(yǎng)液, 2d 后細(xì)胞由70%乙醇固定, PBS 清洗2次, 用含有RNase 10mg/L 和PI 50mg/L 的PBS 在25黑暗條件下染色30min 后, 用流式細(xì)胞儀(Elite ESP , Coulter , USA 檢測每個(gè)周期時(shí)相中的細(xì)胞比例。11216細(xì)胞內(nèi)C a 2+的測定將HHCC 細(xì)胞懸液接種在特制的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)2d , 以臺(tái)氏液清洗細(xì)胞2遍, 用fluo 23/AM (10mol/L 在37避光條件下負(fù)載35min 后又用臺(tái)氏液清洗2遍, 然后置于激光掃描共聚焦顯微鏡(MRC 21024, Bio 2Rad 下掃描7。激發(fā)波長為488nm , 檢測波長為568nm 。

14、掃描時(shí), 對置于臺(tái)氏液的細(xì)胞進(jìn)行掃描作為對照, 然后換為含100mol/L N FA 的臺(tái)氏液作用2min , 最后再換為臺(tái)氏液。在加藥及沖洗過程中, 每10s 掃描1次, 以觀察細(xì)胞內(nèi)Ca 2+的動(dòng)態(tài)變化。11217統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean ±SD 表示, 統(tǒng)計(jì)差異性檢驗(yàn)用t 檢驗(yàn), P <0105為有顯著差異。2結(jié)果211NFA 對HH CC 細(xì)胞增殖的影響用不同濃度N FA 作用于細(xì)胞后, 可見當(dāng)培養(yǎng)液中的N FA 濃度達(dá)到60mol/L 時(shí), 細(xì)胞數(shù)即明顯低于對照組(P <0105 ; 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中的N FA 濃度增加到100mol/L 時(shí), 這種抑制作用進(jìn)

15、一步增加(P <0101 (圖1 , 表明N FA 能抑制HHCC 細(xì)胞增殖, 并具有濃度依賴性 。圖1. 不同濃度NFA 對細(xì)胞增殖的影響Fig 11. E ffects of NFA of different concentrations on the proliferation of HHCC. HHCC are cultured with NFA of dif 2ferent concentrations , and the data are assessed by cell count on a haemocytometer. 3P <0105, 33P <0101

16、vs control.161田晶等:尼氟滅酸對肝癌細(xì)胞增殖的影響212NFA 對HH CC 細(xì)胞MTT OD 值的影響在實(shí)驗(yàn)組中, 用50mol/L 和100mol/L 的N FA 處理后, OD 值明顯低于對照組(P <0101 , OD 值的變化亦與劑量有關(guān), 較大劑量N FA (100mol/L 處理的實(shí)驗(yàn)組, 其OD 值明顯低于較小劑量組(N FA 50mol/L (P <0101 (圖2A 。去除培養(yǎng)液中的N FA 后, OD 值逐漸恢復(fù)(P <0101 (圖2B 。表明N FA 抑制HHCC 增殖是可逆的 。圖2. NFA 對HHCC 細(xì)胞增殖的影響Fig 12.

17、 E ffects of NFA on the proliferation of HHCC. Cell proliferation was measured by colorimetric M TT assay. Data are presented as mean ±SD , n =4wells. A :Dose 2dependent effects of NFA. 33P <0101vs control ; #P <0101vs NFA 50mol/L treated group. B :Reversal effects of NFA. 33P <0101vs

18、control ; #P <0101vs NFA 2treated group.213細(xì)胞周期時(shí)相改變流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示, 對照組G 1期和S 期細(xì)胞數(shù)分別為5710%、3412%, 增殖指數(shù)(S +G 2/G 1+S +G 2 為4311%(圖3A ; 而在N FA (100mol/L 作用組, G 1期細(xì)胞數(shù)明顯增多, 為7113%, 而S 期細(xì)胞數(shù)降到2019%, 增殖指數(shù)為2817%(圖3B 。重復(fù)3次均得出相似的結(jié)果(P <0105 。說明N FA 使細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生改變, 抑制細(xì)胞從G 1期過渡到S 期, 使細(xì)胞增殖停滯在G 1期。DMSO (0112% 對細(xì)胞增殖無作

19、用(P >0105 (數(shù)據(jù)未顯示 , 表明N FA 的作用與所用溶媒DMSO 無關(guān) 。圖3. NFA 對細(xì)胞周期的影響Fig 13. E ffect of NFA on the cell cycle of cultured HHCC. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. A :Control. B :In the presence of NFA (100mol/L .261生理學(xué)報(bào)Acta Physiol. Si n . , April 25, 2003, 55(2 :160-164214細(xì)胞內(nèi)C a 2+的變化用激光掃描共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)

20、觀察細(xì)胞內(nèi)游離鈣的變化, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外應(yīng)用N FA (100mol/L 2min 后細(xì)胞內(nèi)Ca 2+即明顯減少, 去除N FA 后約3min , 細(xì)胞內(nèi)Ca 2+水平可恢復(fù)到對照水平(P <0105 (圖4 。圖4. NFA 對細(xì)胞內(nèi)Ca 2+的影響Fig 14. Influence of NFA on intracellular Ca 2+level. Con , control ; NFA , extracellular application of Tyrode s solution containing NFA (100mol/L ; NFA washout , Tyrode s

21、so 2lution containing 100mol/L NFA was replaced by Tyrode ssolution. n =3cells. 3P <0105vs control ; #P <0105vs NFA.3討論本研究發(fā)現(xiàn), Cl -通道阻斷劑N FA 能抑制肝癌HHCC 的增殖, 使細(xì)胞增殖停滯在G 1期。細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞周期包括有絲分裂期和分裂間期。分裂間期為細(xì)胞分裂做準(zhǔn)備, 又分為三期:合成前期(G 1 、合成期(S 、合成后期(G 2 。G 1期是細(xì)胞質(zhì)復(fù)制的主要階段, 蛋白質(zhì)、RNA 及多聚核蛋白體都在此期合成。氯通道阻斷劑N

22、FA 使細(xì)胞增殖停滯在G 1期, 提示氯通道可能在細(xì)胞增殖由G 1期過渡到S 期這一過程中起重要作用。Ca 2+i 在細(xì)胞增殖活動(dòng)中起重要作用。細(xì)胞由靜息期到增殖活動(dòng)期、G/S 的過渡過程、S 期及分裂停止等都與Ca 2+有關(guān)8。Ca 2+影響細(xì)胞增殖活動(dòng)與Ca 2+/CaM 依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有密切關(guān)系, 抑制鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯在G 1期, 從而阻斷細(xì)胞周期的正常進(jìn)行9,10。本研究觀察到N FA 能顯著地降低Ca 2+i , 使細(xì)胞增殖停滯在G 1期, 提示N FA 抑制細(xì)胞增殖可能是通過影響Ca 2+/CaM 依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起作用, 其詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。N FA

23、 是一種常用的Cl -通道阻斷劑。目前發(fā)現(xiàn), 它對多種Cl -離子通道均有阻斷作用, 如鈣激活Cl -通道、容積敏感型Cl -通道以及囊性纖維跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)體(CF TR Cl -通道 等。同時(shí)研究還表明, 它對其它非Cl -通道也產(chǎn)生影響11。Cl -通道阻斷劑影響其它離子通道活動(dòng)是一種普遍現(xiàn)象。最近我們在心肌上發(fā)現(xiàn), 陰離子替代Cl -和Cl -通道阻斷劑(包括N FA 對Ca 2+通道的影響可能涉及到Cl -通道對Ca 2+通道的直接調(diào)控作用, 即Cl -通道阻斷劑通過抑制Cl -通道, 繼而導(dǎo)致Ca 2+通道活性降低, 使細(xì)胞內(nèi)Ca 2+減少11。本文結(jié)果顯示, N FA 對癌細(xì)胞Ca

24、2+i 的影響與在心肌細(xì)胞上所觀察到的現(xiàn)象非常相似, 提示N FA 的作用機(jī)制可能涉及Cl -通道與Ca 2+通道之間的相互作用, 這一假設(shè)目前正在進(jìn)一步驗(yàn)證當(dāng)中。Cl -通道廣泛地分布于各種細(xì)胞質(zhì)膜上, 它們除了在細(xì)胞的電活動(dòng)中起重要作用外, 還與細(xì)胞其它的生理活動(dòng)有關(guān), 例如, 參與細(xì)胞的容積和細(xì)胞內(nèi)p H 的調(diào)節(jié), 在細(xì)胞的增殖和細(xì)胞遷移等活動(dòng)中都發(fā)揮一定的作用12。因此, 深入研究Cl -通道與腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)系, 對于了解腫瘤細(xì)胞生理和開發(fā)新的抗腫瘤增殖藥物有一定意義。參考文獻(xiàn)1Rouzaire 2Dubois B , Dubois J M. K +channel block 2in

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