小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL定位的初步研究

1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2006,39(5:928-934 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2005-01-07；接受日期：2006-03-03基金項目：國家“十五”攻關(guān)項目（2004BA525B03）和江蘇省自然科學(xué)基金資助項目（BK2004170） 作者簡介： 蔡士賓（1956-）男，江蘇海門人，研究員，碩士，研究方向為小麥種質(zhì)資源。Tel: Fax: E-mail: caisb小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL 定位的初步研究蔡士賓，任麗娟，顏 偉，吳紀(jì)中，陳懷谷，吳小有，張仙義（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南京 210014

2、）摘要：【目的】紋枯病已成為影響中國小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要病害之一，創(chuàng)造抗紋枯病小麥種質(zhì)，并探討其抗性遺傳特點，是啟動小麥抗紋枯病遺傳育種研究的基礎(chǔ)?！痉椒ā恳灾袊N中很少利用的ARz 和Niavt14為紋枯病抗源，以大面積推廣品種揚麥158等為受體親本，通過復(fù)交組合，聚合抗病基因；用單粒傳法構(gòu)建含137個重組自交系A(chǔ)Rz/揚麥158遺傳群體為材料，以致病力較強(qiáng)的R-46菌株為紋枯病病原，分別用溝帶接菌法和牙簽接菌法進(jìn)行抗紋枯病的接菌鑒定?！窘Y(jié)果】創(chuàng)造出02P12、02P315等兼抗紋枯病、赤霉病或白粉病的新種質(zhì)；ARz/揚麥158群體在牙簽接菌法中，病情指數(shù)介于29.8%64.4%之間，在溝

3、帶接菌法中，病情指數(shù)介于25%75%之間，病情指數(shù)均呈正態(tài)分布，具數(shù)量遺傳的特點；單標(biāo)記分析法對97個在抗感池或親本間呈多態(tài)性的位點進(jìn)行回歸分析，獲得Xgdm67等11個與紋枯病抗性極顯著相關(guān)的SSR 標(biāo)記，能解釋群體紋枯病病情指數(shù)變異的5.0%13.0%，其中Xgwm247、Xgdm67、Xwmc94和Xgwm437在牙簽接菌法和溝帶接菌法的抗性資料中都能檢測到；用MapManager QTXb17 建立了14 條連鎖區(qū)段,并用區(qū)間作圖法檢測到與小麥紋枯病抗病相關(guān)的2個QTL 位點，其中，Xgdm67Xbarc172之間的QTL 在兩種接種條件下都能檢測到，LOD 值分別為4.0和3.63，

4、能夠解釋表型變異14.36%和12.3%；Xwmc94Xwmc273.2之間的QTL 只能在牙簽法中檢測到，其LOD 值和貢獻(xiàn)率分別為2.3和14.68%?！窘Y(jié)論】初步認(rèn)為在7D 上存在抗小麥紋枯病的主效QTL。關(guān)鍵詞：小麥；紋枯?。环N質(zhì)創(chuàng)新；QTL分析Germplasm Development and Mapping of Resistance to SharpEyespot (Rhizoctonia cerealis in WheatCAI Shi-bin, REN Li-juan, YAN Wei, WU Ji-zhong, CHEN Huai-gu, WU Xiao-you, ZHAN

5、G Xian-yi（Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014）Abstract : 【Objective 】Sharp eyespot (Rhizoctonia cerealis is one of the important diseases in wheat production in China. Due to lack of knowledge on the inheritance of resistance, little progress has been made in wheat breeding for

6、sharp eyespot resistance. 【Method 】In this study, the newly evaluated ARz and Niavt 14 were used as sharp eyespot resistant donors, and crossed with widely released cultivars such as Yangmai 158, respectively. At the meantime, ARz/Yangmai 158 genetic population was developed using SSD method with 13

7、7 F6 RILs. The 137 RILs and the parents were inoculated with the fungi culture R-46 in F6 using cultured toothpick method and seedbed method, respectively, in 2003.【Result 】Novel germplasms, such as 02P12 and 02P315, with multiple resistance and promising agronomic traits were developed. The RIL pop

8、ulation showed normal distribution of disease index, with disease index 29.8%-64.4% in cultured toothpick method and 25%-75% in seedbed method, indicating the resistance is a quantitative trait. By using marker regression analysis, 11 SSR markers associated with resistant QTL were found based on the

9、 disease index data, explaining 5.0%-13% of phenotypic variance. Among them, Xgwm247, Xgdm67, Xwmc94, and Xgwm437 were detectable in both inoculating methods. QTL mapping of resistance to sharp eyespot was conducted using MapManager QTXb17, 14 linkage groups were established. Two QTLs on chromosome

10、7D related to the resistance were found by composite interval mapping analysis. One QTL between Xgdm67 and Xbarc172 could been detected, explaining 14.36% and 12.3% of the phenotypic variance, in cultured toothpick and seedbed inoculation conditions respectively. Whereas the another QTL between Xwmc

11、94 and Xwmc273.2 was only5期 蔡士賓等：小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL 定位的初步研究 929been found under the toothpick inoculation, explaining 14.68% of the phenotypic variance. 【Conclusion 】 It was deduced that there is a major QTL conferring to resistance to sharp eyespot on 7D in wheat.Key words: Wheat (Triticum aestivum L.;

12、 Sharp eyespot; Germplasm development; QTL analysis0 引言【本研究的重要意義】小麥紋枯病又稱尖眼點?。╳heat sharp eyespot），主要是由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）的第一菌絲融合群（CAG-1），立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的第四和第五融合群（AG-4，AG-5）引起的一種土傳病害1。近年來隨著小麥生產(chǎn)水平的不斷提高，氮肥的大量使用，耕作制度的改變，感病品種的大面積使用，加之全球氣候變暖的影響，導(dǎo)致紋枯病菌大量累積，紋枯病呈逐年加重的趨勢。據(jù)全國植保專業(yè)統(tǒng)計資料統(tǒng)計，全國小麥紋枯

13、病發(fā)生面積1990年為365萬ha ，1998年達(dá)到1145萬ha ，每年遭受紋枯病危害的麥田面積約占種植面積的五分之一3，已成為長江流域及黃淮平原麥區(qū)的主要病害4。紋枯病腐敗了莖、鞘運輸組織和機(jī)械組織，影響了物質(zhì)運輸和植株的抗倒性，導(dǎo)致嚴(yán)重減產(chǎn)，小麥紋枯病引起的產(chǎn)量損失一般在10%左右，重者可達(dá)30%40%、甚至更高，給小麥產(chǎn)量帶來了巨大損失2。因此，小麥紋枯病已成為影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要因素?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今為止，全國各育種單位已對幾千份普通小麥材料進(jìn)行了抗紋枯病鑒定。結(jié)果一致認(rèn)為：在鑒定的眾多材料中，品種間抗性差異非常明顯，但無免疫材料，高抗（抗）材料較少；生產(chǎn)上廣泛使用的小麥品種

14、及其核心種質(zhì)都不抗紋枯病，缺乏抗病品種是小麥紋枯病大面積流行的一個重要原因5,6。江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所連續(xù)3年對上千份國內(nèi)外材料進(jìn)行了抗性鑒定，篩選出Navit14、ARz 等一批高抗紋枯病小麥資源7。但已篩選出的這些抗性種質(zhì)農(nóng)藝性狀有嚴(yán)重缺陷。對這些材料進(jìn)行加工改造，創(chuàng)造抗性穩(wěn)定，農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新種質(zhì)是當(dāng)前小麥紋枯病抗病育種工作的重要任務(wù)?！颈狙芯壳腥朦c】小麥紋枯病為腐生性病害，受環(huán)境因素影響較大，抗病遺傳機(jī)制的復(fù)雜，關(guān)于小麥抗紋枯病的遺傳研究較少 8,9。生物技術(shù)的迅速發(fā)展為小麥抗紋枯病研究提供了新的途徑。以DNA 為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)極大程度地揭示不同材料間DNA 分子水平上的

15、差異，從而為基因的分子定位和標(biāo)記提供了可能。近年來，有關(guān)水稻紋枯病抗性基因的分子標(biāo)記和QTL 定位進(jìn)展較快，已找到了一些與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記位點10,11?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究在已篩選出抗紋枯病資源的基礎(chǔ)上，利用綜合性狀優(yōu)良的農(nóng)藝親本對其改良，以創(chuàng)造出可以供育種上直接利用的抗紋枯病新種質(zhì)；同時用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對小麥抗紋枯病基因進(jìn)行連鎖分析和QTL 定位，為小麥抗紋枯病育種提供親本資源和選擇依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料選用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鑒定出的ARz 、Niavt14等作為小麥紋枯病抗性親本，望水白等為赤霉病抗源、CI12633和Maris Dove為白粉病抗源7，以大面積

16、推廣品種揚麥158等為受體親本，配制雜交、回交或復(fù)交組合，聚合抗病基因，改良抗源的農(nóng)藝性狀。同時，用SSD 法構(gòu)建ARz/揚麥158雜交組合的重組自交系群體，直至F 6，得到137個株系。 1.2 抗性鑒定用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的具較強(qiáng)致病力菌株R46為紋枯病菌系5，采用播種溝土壤接菌法和牙簽接菌法兩種方法人工誘發(fā)紋枯病。播種溝土壤接菌法是將紋枯菌在煮熟的麥粒上培養(yǎng)，待麥粒表面長滿菌絲后待用。小麥播種開行后，先將培養(yǎng)好的帶菌麥粒均勻撒與播種溝內(nèi)，每平方米接種帶菌麥粒3 g，后播種試驗材料，再覆土、保濕35 d；牙簽接菌法是將0.81.0 cm長的短牙簽水浸30 min，鋪于培養(yǎng)皿

17、底部，加入適量M S 培養(yǎng)基，經(jīng)高溫濕熱滅菌后，接種紋枯菌菌絲塊，25恒溫培養(yǎng)30 d，待菌絲密集布滿短牙簽表面后待用。小麥拔節(jié)期將經(jīng)上述方法處理的短牙簽嵌入到基部第12葉鞘之間，每株系接種30個莖稈，噴水保濕7 d11。乳熟期分04級調(diào)查紋枯病病級2，0級: 無病；1級: 葉鞘有典型病斑，但病菌未侵入莖稈；2級：病斑寬度占莖稈周長的1/2 以下；3級：病斑寬度超過莖稈周長的1/2，小于3/4；4級：病斑寬度超過莖稈周長的3/4，莖稈軟腐，白穗。并計算病情指數(shù)情5，病情指數(shù)=(0×x0+1×x1+2×x2+ 3×x3+4×x4/(x0+x1+x

18、2+x3+x4×4×100，式中：x 0,x 1,，x 4分別代表0,1,4 級的莖稈數(shù)。同時，對創(chuàng)新材料采用播種溝帶接菌法人工誘發(fā)紋枯病，揚花期用小花滴注法接種赤霉病混合菌株，930 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 39卷20 d后分4級調(diào)查赤霉病病病情；返青期誘發(fā)行接種白粉病天然混合菌種，5月中旬分9級調(diào)查白粉病病情，進(jìn)行抗病性和農(nóng)藝性狀鑒定和選擇。 1.3 SSR分析用CTAB 法12提取ARz/揚麥158雜交組合兩個親本和137個F 6重組自交系株系幼葉的基因組DNA 。利用276對SSR 引物，對抗感親本ARz 、揚麥158進(jìn)行多態(tài)性篩選。PCR 反應(yīng)在Perkin-El

19、mer 9600上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 µl，包括1×buffer ，1.5mmol·L-1的MgCl 2，2.0 mmol·L-1的dNTPs ，250 nmol·L-1的引物，4080 ng的DNA 和1U 的Taq 聚合酶。具體程序如下：反應(yīng)體系先在94預(yù)變性5 min；然后在94變性1min ，50，55或60復(fù)性1 min（根據(jù)不同引物的退火溫度），72 延伸1 min的程序下擴(kuò)增，36個循環(huán)；最后在72保溫10 min，4保存。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠（0.4 mm）上進(jìn)行電泳，恒功率80W ，電泳時間約2 h后銀

20、染，實驗程序參照文獻(xiàn)13進(jìn)行，最后干燥膠片進(jìn)行帶型統(tǒng)計。 1.4 數(shù)據(jù)分析1.4.1 單標(biāo)記方差分析 使用MapManager QTXb1714的Marker Regression功能對2次的紋枯病病情指數(shù)和多態(tài)性位點的基因型進(jìn)行回歸分析，P <0.01。1.4.2 構(gòu)建遺傳連鎖群與QTL 定位 利用MapMaker/Exp3.0b15對多態(tài)性位點進(jìn)行遺傳連鎖圖的構(gòu)建：輸入各標(biāo)記譜帶的賦值（賦揚麥158的基因型為“A ”，ARz 為“B ”，具有親本任一基因型的賦為“A ”或“B ”，兩者兼有或均無兩者帶型的定為“”。由Kosambi 函數(shù)計算遺傳距離，以LOD 值大于3.0，最大遺傳距

21、離為50 cM建立連鎖群。利用Windows QTL Cartographer Version 2.0進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖。以2003年的2次鑒定資料作為兩個性狀，雜交類型選擇RIL ，遺傳距離采用Kosambi 函數(shù)計算，單位距離選擇Cent Morgan，分別輸入標(biāo)記的名稱、位置、基因型和病情指數(shù)等參數(shù)，然后進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖（composite interval mapping）。具體過程參照文獻(xiàn)16。2 結(jié)果與分析2.1 抗紋枯病種質(zhì)的創(chuàng)新項目組自1998年起，利用鑒定出的紋枯病抗源與抗赤霉病或白粉病抗源互交，再與農(nóng)藝性狀優(yōu)良的核心親本復(fù)交，雜種后代用播種構(gòu)土壤接菌法誘發(fā)紋枯病、用單花滴注法

22、接種赤霉病、用誘發(fā)行接種白粉病。經(jīng)連續(xù)多年抗病性鑒定和農(nóng)藝性狀選擇，獲得了02P315、03-885、02-193等紋枯病和赤霉病病級在1.5以下，白粉病病級在1以下，綜合農(nóng)藝性狀得到較大改善的新種質(zhì)（表1）。02P315 （揚麥158/Maris Dove/揚麥3號/3/ARz）F 7，紋枯病1.21.4級，白粉病0級，赤霉病1.1級。株高8890 cm，抽穗期4月12日，長芒、白殼、紅粒，每穗結(jié)實39.4粒，千粒重3540 g；02P12 (CI12633/寧8026/望水白/揚麥158F 7，紋枯病1.11.4級，赤霉病0.7級，白粉病1級。株高95102 cm，抽穗期4月12日，長芒、

23、白殼、紅粒，主穗結(jié)實40粒，千粒重30 g左右；資03-885（揚94-124/寧麥資18/Niavt 14）：紋枯病和赤霉病均為1.1級，白粉病近免疫、抽穗期4月12日，與大面積推廣品種揚麥158相同，株高95 cm，每穗45.2粒，千粒重35.7 g；資02-192（陜1868/Compton/揚麥6號）：紋枯病1級、赤霉病1.2級、對白粉病免疫，抽穗期4月12日，株高82 cm，每穗38.3粒，千粒重38.4 g。 2.2 抗紋枯病性的遺傳分析2.2.1 ARz/揚麥158重組自交系群體紋枯病病情指數(shù)分布 親本ARz 、揚麥158及其重組自交群體F 6株系在2003年分別進(jìn)行了牙簽法和播

24、種溝帶菌麥粒接菌法的紋枯病抗性鑒定, ARz二種接種條件下的病情指數(shù)分別為34.0%和31.6%，而揚麥158分別為65.0%和54.2% ，表明牙簽法的接種強(qiáng)度效果明顯好于播種溝帶菌麥粒接菌法，ARz 對紋枯病的抗性明顯強(qiáng)于揚麥158。重組自交系群體在溝帶接菌法中平均病情指數(shù)為39.0%，分布在25.075.0之間；在牙簽接菌法中，平均病情指數(shù)為45.2%，分布在29.864.4之間（圖1）。2次鑒定資料的偏度和峰度均較小，符合正態(tài)分布，適合QTL 區(qū)間作圖。2.2.2 單標(biāo)記方差分析 本試驗共分析了276個SSR 引物，其中158個引物在抗感親本間顯示多態(tài)性?？垢杏H本間多態(tài)性頻率為57.2

25、5%。為加快本研究的進(jìn)程，根據(jù)ARz/揚158重組自交系群體的紋枯病鑒定結(jié)果，利用6個極感株系和6個極抗株系構(gòu)建抗感池，利用集群分離分析方法（BSA ），對親本之間有多態(tài)性的158對SSR 引物在抗感池中進(jìn)行篩選，找到了32對在抗感池間有多態(tài)性的SSR 引物，并對上述在抗感池間呈多態(tài)性的位點進(jìn)行了群體基因型分析。 為了進(jìn)一步增加連鎖群上標(biāo)記的豐度和克服BSA 對微效QTL 檢測率低的缺點，筆者先后增加了一些在親本間呈多態(tài)性的標(biāo)記位點進(jìn)行群體基因5期 蔡士賓等：小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及QTL 定位的初步研究 931表1 部分抗紋枯病新種質(zhì)的主要性狀表現(xiàn)Table 1 Disease ratings

26、 and main agronomic traits in some enhanced germplasm紋枯病病級 Scale of sharp eyespot 品系 Line來源 Pedigree2003 2004赤霉病病級Scale of scab白粉病病級Scale of powdery mildew 株高 Plant height (cm抽穗 Heading date (m/d穗粒數(shù) Grain number02P12 CI12633/寧8026/望水白/揚麥158CI12633/Ning8026/Wangshuibai/Yangmai1581.1 1.4 0.7 1 102 4/1

27、2 40.4 02P189 CI12633/揚麥3號/ARZ/揚麥158CI12633/Yangmai3/ARz/yangmai 1581.3 1.7 1.3 0 96 4/12 28.8 02P279 Niavt14/淮麥17Niavt14/Huaimai171.1 1.3 0.9 0 102 4/20 41.7 02P288 Niavt14/淮麥17/西風(fēng)小麥/寧9312Niavt14/Huaimai17/Xifeng/Ning 93121.0 1.3 0.6 0 83 4/12 46.1 02P315 揚麥158/Maris Dove/揚麥3號/3/ARzYangmai158/Maris

28、 Dove/ Yangmai3 /3/ARz1.2 1.4 1.1 0 88 4/13 39.4 02P338 Niavt14/淮麥17Niavt 14/Huaimai 171.2 1.3 1.3 0 104 4/13 35.0 02-S280 ARz/揚麥158ARz/Yangmai 1581.3 1.2 1.2197 4/1432.7 02-192 陜1868/Compton/揚麥6號Shan1868/Compton/Yangmai 61.0 1.2 0 82 4/11 38.403-885 揚94-124/寧麥資18/Niavt 14Yang94-124/Ningmaizi18/Niav

29、t141.1 1.1 0； 95 4/12 45.2 揚麥158 Y angmai 158 對照 Check 2.8 2.6 1.7 7 90 4/12 40.2 ARz 供體，The Donor 1.01.23.091104/1826.3 圖1 ARz/揚麥158RIL 群體二種接種方法病情指數(shù)分布（2003）Fig. 1 Distribution of the disease index in ARz/Yangmai 158RIL population under 2 inoculation methods in 2003型分析，總計獲得97個位點。結(jié)合2次的紋枯病鑒定資料，利用Mapma

30、nager QTXb17軟件對97個位點進(jìn)行回歸分析，P <0.01，獲得與紋枯病抗性極顯著相關(guān)的SSR 標(biāo)記11個（表2），它們解釋群體紋枯病病情指數(shù)變化幅度介于5.0%13.0%之間。其中Xgwm247（3B ）、Xgdm67（7D ）、Xwmc94（7D ）和Xgwm437（7D ）在兩份紋枯病鑒定資料中都能檢測到，表明在染色體3B 和7D 上可能存在與紋枯病抗性相關(guān)的QTL 。2.2.3 連鎖圖的構(gòu)建與QTL 分析 用MapMaker/ Exp3.0b 軟件對97個多態(tài)性位點進(jìn)行遺傳作圖，獲得了由75個位點構(gòu)成14個連鎖區(qū)段，覆蓋1068 cM，平均間距14.25 cM。在這14

31、個連鎖群中，以位于染色體2D 上的連鎖群的區(qū)段最長，其遺傳距離為145.1 cM ；位于染色體3D 上的連鎖群上較為均勻地分布著6個標(biāo)記，標(biāo)記順序與Roder 等構(gòu)建的連鎖圖順序一致，長度62.4 cM；而位于染色體7D 上連鎖群上由9個標(biāo)記位點組成，前面8個較為密集，兩個標(biāo)記間最小距離僅為3.7 cM，最后兩個標(biāo)記間有一較大的間距，共覆蓋長度131.8 cM。其它連鎖群的標(biāo)記相對較少，分布于染色體2A 、2B 、3A 、和7B 上。另有22個位點是獨立的，不能歸屬于某一個連鎖群。使用QTL Cartgrapher軟件對與群體紋枯病抗性顯著相關(guān)的連鎖群進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖(CIM。結(jié)果表明，在7D

32、 染色體上Xgdm67Xbarc172和Xwmc94932 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 39卷Xwmc273.2之間存在二個抗性QTL ，其中，Xgdm67Xbarc172之間的QTL 在牙簽和土壤接種條件下都能檢測到，LOD 值分別為4.0和3.63，能夠解釋表形變異14.36%和12.3%；Xwmc94Xwmc273.2之間的QTL 只能在牙簽法中檢測到，其LOD 值和貢獻(xiàn)率分別為2.3和14.68%（表3）。表2 ARz/揚麥158RIL 中與紋枯病抗性QTL 有關(guān)的SSR 標(biāo)記(P <0.01Table 2 SSR markers associated with sharp eyes

33、pot resistance in ARz/Yangmai 158 RILs (P <0.01牙簽法Toothpick inoculation 土表法Seedbed inoculation 標(biāo)記（染色體位置） Marker(Chromosome location % P % P Xgwm102 (2D 80.00174-Xgwm247（3B ） 6 0.00380 9 0.00065 Xbarc172.1（7D ） 9 0.00030 -Xgdm67（7D ） 13 0.00001 60.00409Xgwm190 (5D - - 5 0.00573 Xwmc273（7D ） - - 5

34、0.00588 Xgwm32 (3A - - 5 0.00894 Xwmc326 (3B - - 6 0.00693 Xgwm314 (3D 60.00520-Xwmc94（7D ） 6 0.00440 8 0.00053 Xgwm437（7D ）10.1 0.00009475.00.005 圖2 部分遺傳連鎖群及抗紋枯病性QTL (黑色區(qū)域表示抗性QTLFig.2 Two linkage groups and sharp eyespot resistance QTL9(Dark area indicates QTL3 討論3.1 小麥紋枯病抗性的鑒定方法小麥紋枯病為一種腐生性病害，其發(fā)病程度

35、受環(huán)境影響較大，準(zhǔn)確評價實驗材料對紋枯病的抗感表現(xiàn)是進(jìn)行該性狀遺傳分析和育種研究的前提。紋枯病研究工作者嘗試了不同的接種方法，試圖創(chuàng)造一個相對穩(wěn)定的發(fā)病環(huán)境，以獲得較為可靠的抗性資料。史建榮等5在小麥紋枯病研究中，使用溝帶接菌法，將致病菌接種于滅菌的玉米砂，再將布滿菌絲的玉米砂均勻播種于小麥播種溝，這樣鑒定的株系在苗期至孕穗期一直處于真菌的侵染環(huán)境中，提供一個相對穩(wěn)定的接種條件。潘學(xué)彪等11在水稻抗紋枯病遺傳育種試驗中，發(fā)現(xiàn)嵌入法效果較好；陳厚德等將嵌入法用于大麥紋枯病病菌的接種，并與外貼法作了對比試驗，發(fā)現(xiàn)利用嵌入法接種的效果明顯優(yōu)于外貼法。本試驗采用牙簽法和溝帶法的兩種方法接種同一個自交系

36、群體，結(jié)果表明，溝帶法從播種到灌漿，小麥植株一直處于誘發(fā)環(huán)境中，病程長，感病植株的病級高，但同一材料的不同植株間病級變異較大。牙簽嵌入法是在拔節(jié)期將病菌菌絲直接接種于葉鞘和莖稈之間，同一材料的不同植株間病級變異較小，但病程短，感病植株的病級相對較低。兩種方法之間的病情指數(shù)呈極顯著相關(guān)（P <0.0001），表明牙簽接菌法和溝帶法都是評價小麥紋枯病抗性的較為可靠方法。但從本試驗發(fā)現(xiàn)的QTL 數(shù)量、LOD 值和遺傳貢獻(xiàn)率來看，牙簽接菌法的實驗精度明顯優(yōu)于溝帶法，因此牙簽接菌法較適合于對少量材料抗紋枯病遺傳研究；而溝帶法更適5期 蔡士賓等：小麥抗紋枯病種質(zhì)創(chuàng)新及 QTL 定位的初步研究 933

37、 表 3 復(fù)合區(qū)間作圖分析檢測到的抗紋枯病 QTL Table 3 QTLs associated with sharp eyespot resistance detected by composite internal mapping method 標(biāo)記區(qū)間 Interval Xgdm67-Xbarc172 Xgwmc94-Xwmc273.2 染色體位置 Chromosome location 7D 7D 接種方法 Inoculating method 土壤接種 Seedbed 牙簽接種 Cultured toothpick 牙簽接種 Cultured toothpick LOD 值 LOD

38、 value 3.63 4.00 2.30 貢獻(xiàn)率 Var (% 12.3 14.36 14.68 抗性基因來源 The donor of resistant QTLs ARz ARz ARz 合于大量品種的篩選鑒定。溝帶法和牙簽法可以有效 地互為補(bǔ)充。 3.3 小麥抗紋枯病性的遺傳改良 由于缺乏抗源，小麥抗紋枯病育種進(jìn)展緩慢，到 目前為止生產(chǎn)上大面積推廣的品種多為感病品種，有 利于紋枯病的發(fā)生、流行和危害，以致近年來小麥紋 枯病危害日趨嚴(yán)重 6,7 在牙簽和土壤接種條件下都能檢測到，Xwmc94 Xwmc273.2 之間的 QTL 只能在牙簽法中檢測到。 References 1 陳延熙,

39、唐文華, 張敦華, 簡小鷹. 我國小麥紋枯病病原學(xué)的初 步研究. 植物保護(hù)學(xué)報, 1986, 13(1: 39-44. Chen Y X, Tang W H, Zhang D H, Jian X Y. A preliminary study on etiology of sharp-eyespot of wheat in China. Acta Phytophylacica Sinica, 1986, 13(1: 39-44. (in Chinese 2 王裕中, 吳志鳳, 史建榮, 陳懷谷, 邵伯坤. 小麥紋枯病流行規(guī)律 研究. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 1993, (麥類紋枯病專輯: 48-53.

40、Wang Y Z, Wu Z F, Shi J R, Chen H G, Shao B K. Study on epidemic regularity. Jiangsu Agricultural Sciences, 1993, (Special issue: 48-53. (in Chinese 3 趙美琦, 畢可政. 小麥紋枯病流行預(yù)測的研究. 植物保護(hù)學(xué)報, 1997, 24(4: 303-308. Zhao M Q, Bi K Z. Study on epidemic prediction of sharp eyespot in wheat. Acta Phytophylacica Si

41、nica, 1997, 24(4: 303-308. (in Chinese 4 黃承彥, 楊平平, 楚秀生, 單承榮. 見: 莊巧生, 杜振華. 中國小 麥育種研究進(jìn)展. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1996: 274-279. Huang C Y, Yang P P, Chu X S, Shan C R. In: Zhuang Q S, Du Z H (ed. Advance in Wheat Breeding Research in China. Beijing: Chinese Agricultural Press, 1996: 274-279. (in Chinese 5 史建榮, 王

42、裕中, 沈素文, 陳懷谷. 江蘇省小麥紋枯病菌致病力 研究. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 1997, 13(3: 188-190. Shi J R, Wang Y Z, Shen S W, Chen H G. Pathogenicity of Rhizoctonia cerealis to wheat in Jiangsu Province. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 1997, 13(3: 188-190. (in Chinese 6 王裕中. 小麥紋枯病發(fā)生與防治. 植保技術(shù)與推廣, 2001, 21(8: 39-41. Wang Y Z. O

43、ccurrence and control of sharp eyespot in wheat. Plant Protection Technology and Extension, 2001, 21(8: 39-41. (in Chinese 7 Cai S B, Cao Y, Fang X W, Zhu Z. Study on resistance to sharp eyespot (Rizoctonia cerealis in wheat germplasm. In: Gao W D, Rao 。目前，小麥紋枯病的防治主要 是應(yīng)用井岡霉素等化學(xué)藥劑于春季噴霧防治，但是由 于病害發(fā)生的部位

44、是在麥稈基部，需要大水量噴藥才 能防治到位，而麥田的旱作生態(tài)特點，特別是在少水 地區(qū)或南方春季多雨不易下田， 很容易錯過防治適期， 會使春季大面積噴藥防治的措施難以實施。而且大規(guī) 模使用化學(xué)藥劑還會對生態(tài)環(huán)境造成危害。本研究利 用育種和生產(chǎn)很少利用的 ARz、Navit 14、CI12633 等 紋枯病抗源，創(chuàng)新獲得了人工誘發(fā)條件下，紋枯病穩(wěn) 定在 1.5 級以下，兼抗其它主要病害，農(nóng)藝性狀大為 改善的新種質(zhì)。加快這些材料的利用，選育和推廣抗 紋枯病的小麥新品種， 將是解決紋枯病危害的最直接、 有效、經(jīng)濟(jì)的途徑。 4 結(jié)論 4.1 利用聚合改良技術(shù)， 將不同抗性基因?qū)牒诵挠H 本，獲得了 02

45、P315、03-885、02-192 等紋枯病和赤霉 病病級在 1.5 以下，白粉病病級在 1 以下，綜合農(nóng)藝 性狀得到較大改善的新種質(zhì)。 4.2 分別用牙簽法和溝帶法鑒定了 ARz/揚麥 158 重 群體的病情 組自交群體 137 個 F6 株系的紋枯病抗性， 指數(shù)分布在 25%75%之間，偏度和峰度均較小，符 合正態(tài)分布，適合 QTL 區(qū)間作圖。 4.3 利用 MapManager QTXb17 軟件對 97 個多態(tài)性 位點進(jìn)行回歸分析， 獲得 Xgwm247、 Xgdm67、 Xwmc94 和 Xgwm437 等 11 個與紋枯病抗性極顯著相關(guān)的 SSR 標(biāo) 記 ，它 們解 釋 群體 紋

46、枯 病 病情 指數(shù) 表 型變 異的 5.0%13.0%。 4.4 用復(fù)合區(qū)間作圖分析法獲得位于 7D 染色體上的 二個抗性 QTL， 其中， Xgdm67Xbarc172 之間的 QTL 934 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 39 卷 V R, Zhou M D (ed. Plant Genetic Resources Conservation and use in China, Proceedings of National Workshop on Conservation and Utilization of Plant Genetic Resources, 25-27 Oct. 1999 Be

47、ijing, China. Beijing: IPGRI Office for East Asia, 2001: 135-136. 8 劉朝暉，張 旭，李浩兵, 姚景俠. 小麥品種紋枯病抗性遺傳的 12 Rhizoctonia solani in rice cultivar Jasmine 85. Chinese Science Bulletin, 1999, 44(15: 1629-1635. (in Chinese 薩姆布魯克, 拉塞爾著. 黃培堂譯. 分子克隆實驗指南 （第三版） . 北京: 科學(xué)出版社, 2002. Sambrook J, Russell D W (ed. Translated by Huang P T. Molecular cloning: A Laboratory Manual (3rd ed. Beijing: Chinese Science Press, 2002. (in Chinese 13 任麗娟, 沈曉蓉, 周淼平, 張 旭 , 馬 鴻 翔 , 陸 維 忠 , Paul 初步研究. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999, 22(3: 5-8. Liu Z H, Zhang X, Li H B, Yao J X. A preliminary study on inheritance of the resistance to s