病毒感染細(xì)胞試驗(yàn)整體流程及原理0001

1、病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理目的基因不能直接整合到大多數(shù)真核細(xì)胞， 常用的手段是將目的基因包裝成 病毒來(lái)感染細(xì)胞，從而得到表達(dá)滿足實(shí)驗(yàn)需求。1、病毒的種類 病毒有很多種，常見(jiàn)的有慢病毒和腺病毒1.1 慢病毒1.1.1 原理慢病毒（ Lentivirus ）是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的 siRNA/miRNA 慢病毒 載體，與化學(xué)合成的 siRNA 和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比， 一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面， Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng) 過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后， 可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原 代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)

2、的細(xì)胞， 并且在感染后可以整合到受感染細(xì) 胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。1.1.2 特點(diǎn)1）直接包裝成為假病毒顆粒，對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞均有感染作用，適合RNAi研究和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 （比如神經(jīng)元細(xì)胞、 干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞 ）。?2）可以通過(guò)簡(jiǎn)單方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)特定基因的多種細(xì)胞株。3）可用于基因敲除、基因治療和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。4）無(wú)需任何轉(zhuǎn)染試劑，操作簡(jiǎn)便。5）可以根據(jù)客戶需要制備多種標(biāo)記。1.1.3 慢病毒包裝簡(jiǎn)要流程：1）含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。2）慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T 等。3）培養(yǎng) 48hrs-7

3、2hrs 左右，收集含有病毒的上清培養(yǎng)液。 4）病毒的純化和濃縮。5）分裝、-80 C保存。6）滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。1.2 、腺病毒1.2.1 原理腺病毒 （Adenovirus ，Ad） 是一種無(wú)包膜的線狀雙鏈 DNA 病毒，其復(fù)制不 依賴于宿主細(xì)胞的分裂。有近 50 個(gè)血清型，大多數(shù) Ad 載體都是基于血清型 2 和5，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復(fù)制能力。這些重組 病毒僅在高水平表達(dá)E1和E3基因的細(xì)胞中復(fù)制，因此是一種適用于治療的高 效控制系統(tǒng)。1.2.2特點(diǎn)1 ）幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞2）可以獲得復(fù)制缺陷型（E1和E3缺失）的腺病毒3） 病毒滴

4、度高，產(chǎn)生病毒經(jīng)過(guò)濃縮后可以達(dá)到1012PFU/mL，能有效的進(jìn)行增 殖。4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡(jiǎn)單5）感染細(xì)胞時(shí)，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險(xiǎn)， 生物安全性高。123腺病毒包裝簡(jiǎn)要流程1 ）構(gòu)建表達(dá)siRNA/miRNA 的腺病毒載體2）采用PacI消化純化的質(zhì)粒。3 ）消化好的腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 293A細(xì)胞，收獲細(xì)胞以制備病毒粗提液。4）將病毒粗提液感染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒。5）分裝，-80 C保存。1.3、慢病毒和腺病毒的比較慢病毒載體系統(tǒng)和腺病毒載體系統(tǒng)比較病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)（Lentivirus ）腺病毒表達(dá)系統(tǒng)（Ad

5、e no virus ）病毒基因組RNA病毒雙鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制是否整合病毒基因組整合于宿主基因組， 長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組游離于宿主基因組 夕卜，瞬時(shí)表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞，適用于難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞）及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)感染分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)風(fēng)度中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間慢（1-3天）快（1-2天）滴度滴度最高可達(dá)10*8pfU/ml滴度最高可達(dá)10*11pfU/ml克隆容量可插入不超過(guò)8kb的外源片段， 滴度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴 度隨插入片段長(zhǎng)度增加而降低免疫原性低免疫原性高免疫原性2、構(gòu)建目的基因到載體

6、2.1 構(gòu)建手段 一般是根據(jù)原始質(zhì)粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。 1)如果原始質(zhì)粒與載體有匹配酶切位點(diǎn)，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回 收并連接到載體，酶切，并測(cè)序鑒定2)如果沒(méi)有匹配的酶切位點(diǎn)， 則設(shè)計(jì)帶有特殊接頭的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 目的片段，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并 測(cè)序鑒定2.2 質(zhì)粒載體能夠進(jìn)行自主復(fù)制的環(huán)狀 DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，包括真核生物的細(xì)胞器(主要指 線粒體和葉綠體)中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸 (DNA) 分子質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因， 例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因 等。有些質(zhì)粒稱為附加體 (epi

7、some) ，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能 從整合位置上切離下來(lái)成為游離于染色體外的 DNA 分子。質(zhì)粒在宿主細(xì)胞體內(nèi) 外都可復(fù)制。通過(guò)個(gè)些特性，人們可以把一些目的 DNA 片斷構(gòu)建在質(zhì)粒中，通 過(guò)轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中， 利用選擇培養(yǎng)基來(lái)篩選從而不斷的復(fù)制， 來(lái)得到目的產(chǎn)物。3 、質(zhì)粒 DNA 在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化 連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌里擴(kuò)增， 然后提取質(zhì)粒，以下是質(zhì)粒 DNA 在大腸桿菌里轉(zhuǎn)化的三步驟。3.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1 ）從大腸桿菌平板上挑取一個(gè)單菌落于3mlLB培養(yǎng)基的試管中，37 C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2） 取0.4ml菌液轉(zhuǎn)接到40ml

8、LB液體培養(yǎng)基中，37 C振蕩培養(yǎng)23h3）菌液轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中，冰上放置 10min4）4 °C 離心 10min （4000r/min ）5）倒出培養(yǎng)液，將管口倒置以便培養(yǎng)液流盡6）用冰浴的 0.1mol/L 氯化鈣 10ml 懸浮細(xì)胞沉淀，立即冰浴 30min7）4 C離心 10min （4000r/min ）8）倒出上清液，用冰浴的 0.1mol/L 氯化鈣 2ml 懸浮細(xì)胞（冰上放置）9）分裝細(xì)胞，200ul 一份，4 C保存3.2 質(zhì)粒 DNA 的轉(zhuǎn)化1 ）取 200ul 新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒 DNA2ul 混勻，冰浴 30min2）離心管放到42 C

9、保溫90s3）冰浴 2min4）每管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37 C培養(yǎng)1h （150r/min ）5）取適當(dāng)體積（ 100ul ）的復(fù)蘇細(xì)胞，涂布在選擇性培養(yǎng)基上，正置 30min6）倒置平皿 37 C， 1216h ，出現(xiàn)菌落3.3 質(zhì)粒提取步驟1）取 14ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液， 12000 轉(zhuǎn)離心 1min ，棄上清2 ）加250ul溶液I /RNaseA （溶液I為細(xì)胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振蕩直 至菌體完全重新懸浮，室溫靜置 1-2min 。3） 加入250ul溶液U （細(xì)胞裂解液），輕柔的反復(fù)顛倒混勻5-6次。室溫放置 1-2min ，使菌體充分裂解，直至形

10、成澄清的裂解溶液。4） 加入350ul溶液川（中和液），立刻輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6次，此時(shí)會(huì)出 現(xiàn)白色絮狀沉淀。5）12000 室溫離心 10min ，收集上清。6）將上清置于 DNA 純化柱中，靜置 1-2min 。7）12000 轉(zhuǎn)離心 1min ，棄濾液。8） 加入500ul溶液PB （洗滌液）12000轉(zhuǎn)離心1min ,棄濾液，目的是將硅膠 膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒 DNA 。9）加入500ul溶液W （去鹽液），12000轉(zhuǎn)離心1min，棄濾液，重復(fù)一次。10）12000 轉(zhuǎn)離心 3min ，以徹底去除純化柱中殘留的液體。11 ）將DNA純化柱置于新的離心管中

11、，懸浮滴加 50-100ul溶液Eluent （為無(wú) 菌的雙蒸水，PH為8.0-8.5 ），室溫放置2min。12） 12000轉(zhuǎn)離心1min，此時(shí)管底即為高純度的質(zhì)粒 DNA，質(zhì)粒于-20 C保 存。質(zhì)粒提取步驟：吸取液體培養(yǎng)基于 1.5ml 離心管中 12000 轉(zhuǎn)離心 1min ，棄上 清，吸取培養(yǎng)基重復(fù)離心棄上清離心， 留取少量菌液作為菌種保存， 可直接置于 -20 C加250ulBufferS1 懸浮細(xì)菌，懸浮均勻加 250ulBufferS2 溫和 充分的上下翻轉(zhuǎn) 4-6 次混合均勻，使菌體裂解加 350ulBufferS3 溫和上下 翻轉(zhuǎn) 12000 離心 10min 取上清液轉(zhuǎn)

12、移到專用的制備管（ 2ml ） 12000 轉(zhuǎn)離 心 1min ，棄濾液加 500ulBufferW112000 轉(zhuǎn)離心 1min ，棄濾液加 500ulBufferW212000 轉(zhuǎn)離心 1min ，棄濾液，重復(fù)一遍將制備管置回 2ml 離心管 12000 轉(zhuǎn)離心 1min 將制備管移入新的 1.5ml 離心管中，加 6080ulEluent 或離子水， 室溫 1min12000 轉(zhuǎn)離心 1min 移去制備管， 將 有質(zhì)粒的離心管于4 C或是-20 C保存4 、質(zhì)粒 DNA 和其他包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞產(chǎn)生病毒（即病毒包裝）4.1 名詞解釋4.1.1293T 細(xì)胞是由 293 細(xì)胞派

13、生 ,表達(dá) SV40 大 T 抗原的人腎上皮細(xì)胞系 ,被廣 泛應(yīng)用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)各種目標(biāo)蛋白 ,或是用以包裝病毒。4.1.2 脂質(zhì)體：某些細(xì)胞質(zhì)中的天然脂質(zhì)小體，可作為生物膜，用于捕獲外源性 物質(zhì)后更有效地運(yùn)送到靶細(xì)胞，經(jīng)同細(xì)胞融合而釋放。4.2 共轉(zhuǎn)染的操作步驟 第一天：用無(wú)抗生素 DMEM+10%FBS 鋪板 293FT 細(xì)胞， 2ml/ 孔。確保第二天 細(xì)胞密度達(dá)到 80%-90% 融合度 第二天：1.500ul 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋 2ug 表達(dá)質(zhì)粒 +1.5ugpsPAX2+1.5ugpMD2.G2.500ul 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋 15ul 脂質(zhì)體 20003.5min 后，將 DNA

14、 溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜止 20min4. 從 6 孔板中吸出 1ml 無(wú)血清培養(yǎng)基，然后滴加入 1ml 質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物。5.6-10h 后，移除含有 DNA- 脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液 DMED+10%FB （從此刻開(kāi)始算時(shí)間）。第三天：1. 轉(zhuǎn)染 24h 后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染效率應(yīng)達(dá)到 70% 以上 第四天：1.轉(zhuǎn)染后 48 和 72h 分別收獲含病毒的上清。2.3000rpm 離心 20min ， 0.45um 濾膜過(guò)濾，去除細(xì)胞沉淀。3.12000 轉(zhuǎn)離心濃縮細(xì)胞、分裝 -80 °C 貯存。4.滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。4.3 病毒包

15、裝的原理質(zhì)粒 DNA 為能轉(zhuǎn)錄出慢病毒遺傳物質(zhì)（ RNA ），但不能翻譯出慢病毒的外 殼及蛋白成分的載體質(zhì)粒， 其同時(shí)連有目的基因和報(bào)告基因， psPAX2 為能表達(dá) 慢病毒外殼的質(zhì)粒，其表達(dá)產(chǎn)物可通過(guò)粘附機(jī)制更易穿過(guò)細(xì)胞膜， pMD2.G 為 慢病毒的膜蛋白質(zhì)粒，通過(guò) lipofectamine2000 進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到靶細(xì)胞基因 組中，宿主基因組在表達(dá)時(shí)，隨宿主基因轉(zhuǎn)錄出的目的基因 RNA 與 psPAX2 、 pMD2.G 基因翻譯出的蛋白組裝為慢病毒。在上述程序中提及的 “第四天”收集病毒。在第五天再用該病毒感染靶細(xì)胞， 病毒進(jìn)入細(xì)胞后，其遺傳物質(zhì) RNA 反轉(zhuǎn)錄出 DNA ，該基因再

16、整合到靶細(xì)胞的 基因組中，完成轉(zhuǎn)染過(guò)程，因?yàn)橘|(zhì)粒 DNA 只能轉(zhuǎn)錄出病毒 RNA 和表達(dá)目的基 因卻不能表達(dá)出病毒的外殼和膜蛋白成分， 因此其不能像普通的病毒一樣在宿主 細(xì)胞能反復(fù)增殖，故對(duì)宿主細(xì)胞是無(wú)害的并且高效的將目的基因轉(zhuǎn)然到靶細(xì)胞基 因組中。5、慢病毒感染細(xì)胞5.1 流程圖5.2 感染步驟1）鋪板：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化重懸后，按 1*105/L 密度接種于 12 孔板， 生長(zhǎng)過(guò)夜2）感染：將 70-80% 鋪滿 12 孔板中的培養(yǎng)液吸除，換新鮮的培養(yǎng)液，同時(shí)加 入 PBS 濃度梯度稀釋的病毒液，混合均勻后即可放入孵箱培養(yǎng)。3）24h 左右可換液， 48 小時(shí)即可看熒光，具體根據(jù)細(xì)胞狀

17、態(tài)來(lái)看。5.3 熒光顯微鏡的操作流程打開(kāi)熒光器（ 30min 內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細(xì)胞培養(yǎng)板置 于載物臺(tái)，調(diào)節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細(xì)胞，再關(guān)閉光，開(kāi)啟熒光 通道，觀察熒光強(qiáng)度，判定感染率。圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時(shí)間，增益值和彩 色度使熒光照片最完美。（針對(duì) leica ）5.4 注意事項(xiàng)內(nèi)容1.病毒濃度要適宜，太少的話細(xì)胞被感染的也少，但是病毒濃度太大，對(duì)細(xì)胞有 傷害。2. 感染病毒時(shí)培養(yǎng)基量少，以保證病毒的濃度，在培養(yǎng) 10h 左右可根據(jù)培養(yǎng)基 顏色加培養(yǎng)基。3. 在不明確細(xì)胞感染復(fù)數(shù)情況下，可進(jìn)行濃度梯度感染，計(jì)算細(xì)胞感染復(fù)數(shù)。4. 在加病毒后一般 24h 左右可

18、換液， 48 小時(shí)即可看熒光，具體時(shí)間根據(jù)細(xì)胞狀 態(tài)來(lái)看。6、感染后的細(xì)胞檢測(cè)方法6.1 熒光初步檢測(cè)若有熒光，則表示病毒感染成功， 但并不能確定目的基因是否整合到細(xì)胞中， 待進(jìn)一步檢測(cè)，熒光有強(qiáng)弱之分，與病毒加入的量有關(guān)。6.2RNA 的提取及 RT-PCR 檢測(cè)因?yàn)檎婧思?xì)胞 DNA 含有很多非編碼區(qū)，真核生物的 DNA 轉(zhuǎn)錄成為 RNA 之后，經(jīng)過(guò)剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的 mRNA ，是否 表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)相應(yīng)的蛋白，只能通過(guò)提取其 mRNA 并 RT-PCR 這 條途徑來(lái)測(cè)定 6.2.2RNA 提取步驟加 1mlTrizol ，吹打后移至 1.5ml 無(wú)菌的離心管中； 加 100ul 氯仿劇烈振蕩 30s 混勻， 12000 轉(zhuǎn) 15min ，可看到明顯分層；取上層透明液體至新的 1.5ml 離心管中，加等體積的異丙醇，混勻靜置 10min ，12000 轉(zhuǎn)離心 10min ，棄上 清，加 1ml70% 乙醇， 12000 轉(zhuǎn)，離心 10m