miRNA的研究方法

1、科研中的miRNA研究方法總結(jié)microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度在22nt左右的內(nèi)源非編碼小 RNA廣泛 存在于動(dòng)物、植物、病毒等多種有機(jī)體中。 1993 年， Lee 等人在秀麗新小 桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了控制著線蟲時(shí)序性發(fā)育的 lin-4 。2000 年， Reinhart 等 發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA：let-7 。隨后的幾年時(shí)間里，許多研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了這類RNA并將這些具有時(shí)空表達(dá)特異性的非編碼小分子 RNA命名為microRNA(miRNA)。從長(zhǎng)的初級(jí) miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的單鏈 miRNA到與靶標(biāo) RNA 結(jié)合，至少需要四步：首先是由核糖

2、核酸酶川 Drosha 和DGCR8組成的復(fù) 合物將初始 miRNA轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA )加工成 miRNA前體(pre-miRNA); 接著由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5 和RanGTP酶將miRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì) 中；第三步是由另一種核糖核酸酶川Drosha將miRNA前體剪切成成熟的 miRNA雙鏈，miRNA雙鏈打幵，其中一條進(jìn)入到 RNA誘導(dǎo)的沉默RISC復(fù)合 體(RISC)中，該復(fù)合體還包含 TarRNA結(jié)合蛋白(TRBP ;最終RISC復(fù) 合體根據(jù)miRNA與靶標(biāo)RNA的互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)靶基因進(jìn)行剪切，或者翻譯抑 制。圖1miRNA生物學(xué)調(diào)控過程(摘自文獻(xiàn) 8)miRN

3、A通過作用于相應(yīng)靶 mRN，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝、 發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。預(yù)測(cè)超過 1/3 的人類基因都是保守的 miRNA靶基因。近些年，隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，大量的miRNA已經(jīng)被鑒定出來，截至目前發(fā)現(xiàn)的人的成熟的miRNA有2578條，小鼠的有1908條。雖然miRNA的數(shù)量很多，但大多 miRNA的功能并不為人所知。因此，準(zhǔn)確 快速地預(yù)測(cè)并鑒定 miRNA的靶基因，對(duì)研究 miRNA的功能具有十分重要的 意義。下面本篇文章將著重介紹一下在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域中如何快速高效的鑒 定與人類疾病相關(guān)的 miRNA及其功能研究方法。一、miRNA的定量檢測(cè)成熟miRNA的片段小，只有

4、21bp左右，變異較大，在不同細(xì)胞中的表達(dá) 差異較大，低表達(dá)的miRNA為其定量檢測(cè)帶來了很大的困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，隨著科學(xué)的進(jìn)步，越來越多的miRNA檢測(cè)方法被建立起來，極大程度的促進(jìn)了 miRNA研究進(jìn)展。下面介紹下在疾病研究中常用的五大miRNA定量檢測(cè)方法。Northernblotting: 是較為經(jīng)典的檢測(cè)各組織和器官中RNA 的量和大小及估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法。主要實(shí)驗(yàn)步驟包括：完整的RNA的分離；根據(jù)RNA的大小通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離；將 RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移過程中，要保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布；將RNA固定到固體支持物上；固相 RNA與探針分子雜交；除

5、去非特異結(jié)合到固相支持物上 的探針分子；對(duì)特異結(jié)合的探針分子的圖像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析。優(yōu)點(diǎn)： 高度靈敏，而且通過結(jié)合 RNAmarker可以檢測(cè)出 miRNA的片段大小，能夠排 除實(shí)驗(yàn)被其他小分子 RNA污染的可能性性，但 Northernblott ing對(duì)樣品的需求量較高，操作步驟繁瑣，不適用高通量分析。微陣列芯片技術(shù)(microarry ):也稱生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技 術(shù)，是一種平面的基質(zhì)載體，上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因的產(chǎn) 物。當(dāng)與熒光標(biāo)記過的樣本雜交后，相應(yīng)位置熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可反映對(duì)應(yīng) 基因表達(dá)的豐度。其優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)miRNA的高

6、通量分析。但芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)miRNA的純度質(zhì)量要求較高，現(xiàn)行的RNA提取為了獲取高質(zhì)量了 RNA往往會(huì)在純化過程丟失掉許多小分子RNA影響一些低表達(dá)RNA的檢測(cè)。另外芯片技術(shù)的一個(gè)突出的缺點(diǎn)就是信息質(zhì)量的穩(wěn)定 性和可重復(fù)性較差。這些方面都需要改進(jìn)。原位雜交：該技術(shù)可以更為直觀的顯示出miRNA的表達(dá)情況，可直接觀測(cè)到miRNA的表達(dá)時(shí)間，表達(dá)分布范圍，具體位置等，不僅可以檢測(cè)不同細(xì) 胞系單個(gè)細(xì)胞中的 miRNA表達(dá)，還可在不經(jīng)分類和分離的情況下，比較不同 細(xì)胞系中 miRNA的表達(dá)水平。但 miRNA分子太小，要對(duì)傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù) 進(jìn)一步改進(jìn)，增加雜交的親和性，結(jié)合牢固性，以防止洗脫過程中的

7、丟失， 造成結(jié)果不準(zhǔn)確。RT-PCR與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏的檢測(cè)出低表達(dá)的miRNA并適合于高通量篩選。由于miRNA分子片段小，研究者們通過對(duì)其反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)使得RT-PCR定量檢測(cè)miRNA成為可能，根據(jù)所用引物的不同可以將其分為兩大類，一類是Oligod(T)特異的RT引物，miRNA在反轉(zhuǎn)錄前需要對(duì)其 3'末端加多聚尾 Poly(A) ，再使用 Oligo-UniversalTag 通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物由可以自身呈莖環(huán)狀的特異序列加上6個(gè)到8個(gè)miRNA3端反相互補(bǔ)堿基組成，一條miR

8、NA序列對(duì)應(yīng)一個(gè)特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物。兩者相比，前者引物設(shè)計(jì)容易且檢測(cè)通量高，但檢測(cè)靈敏度和特異性比后者 低。熒光定量 PCR根據(jù)所用熒光來源不同可以分為SY BRGreen染料法和TagMan探針法。miRNA深度測(cè)序：該技術(shù)能夠直接對(duì)樣本中特定大小的miRNA分子進(jìn)行高通量測(cè)序，可以在無需任何 miRNA序列信息的前提下研究 miRNA勺表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)和鑒 定新miRNA分子。新一代測(cè)序最常使用的3種平臺(tái)是川umina的基因組分析儀、Roche454基因組測(cè)序儀以及 ABLifeTechnologies 的SOLiD系統(tǒng)。因?yàn)閙iRNA勺序列 較短，較多應(yīng)用于 miRNA僉測(cè)的新一代

9、測(cè)序技術(shù)平臺(tái)為Illumi na基因組分析儀和ABLifeTechnologies的SOLiD系統(tǒng)。川umina基因組分析儀具有所需樣品少，數(shù)據(jù) 誤差小，操作流程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。SOLiD系統(tǒng)的讀長(zhǎng)為35nt，且準(zhǔn)確度最高，單次運(yùn)行所得的數(shù)據(jù)量最大，特別適用于miRNA勺研究。而Roche454基因組測(cè)序儀測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá)400500堿基，而miRNA序列長(zhǎng)度僅為22堿基，所以該測(cè)序儀常用于新物種 的基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，極少應(yīng)用于miRNA®序。二、miRNA的靶基因?qū)ふ已芯勘砻鳎粋€(gè)基因可以受多個(gè)miRNA調(diào)控，而一種 miRNA又可以參與調(diào)控多個(gè)靶基因，據(jù)預(yù)測(cè)，至少有30%勺人類基因

10、是 miRNA的靶基因。這就足以顯示出 miRNA群體的重要性。而在人類疾病中多不同程度的表現(xiàn)出大量 miRNA的上調(diào)和下調(diào)，這也足以顯示 miRNA在疾病發(fā)生過程中占據(jù)著非常重要 的作用。而探討 miRNA的功能作用中最重要的一步就是高效準(zhǔn)確的尋找到其 所調(diào)控的靶基因。目前尋找靶基因主要是從以下兩個(gè)方面入手。1生物信息學(xué)方法miRNA靶基因的預(yù)測(cè)主要是根據(jù)生物信息學(xué)的方式進(jìn)行，主要是根據(jù)以下 幾個(gè)方面進(jìn)行預(yù)測(cè)： miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)性； miRNA靶位點(diǎn)在 不同物種之間的保守性； miRNA-mRNA吉合的熱穩(wěn)定性； miRNA靶位點(diǎn)處 不應(yīng)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)；miRNA5端與靶基因

11、的結(jié)合能力強(qiáng)于3端。除以上幾個(gè)基本原則外，不同的預(yù)測(cè)方法還會(huì)根據(jù)各自總結(jié)的規(guī)律對(duì)算法進(jìn)行不同 的限制與優(yōu)化。目前比較常用的靶基因預(yù)測(cè)軟件有：miRanda、 TargetScan 、PicTar、miRWalk、miRanda miRDB等，其中在 miRWalk中可以查找到已經(jīng)被 研究證實(shí)的miRNA的靶基因，也可以查找與某種疾病相關(guān)的miRNA等。雖然靶基因預(yù)測(cè)軟件很多，但其預(yù)測(cè)特異性和敏感度還有待改善，一個(gè) 軟件針對(duì)一個(gè) miRNA通常可以預(yù)測(cè)出上千條靶基因，這就為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 帶來了許多困難，雖然我們可以結(jié)合多個(gè)軟件進(jìn)行miRNA的靶基因預(yù)測(cè)，但在取幾個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集時(shí)也忽略了許

12、多真實(shí)的靶基因，在這兩者之間 的權(quán)衡就需要我們研究者去綜合參考其他方面的因素來抉擇。比如，我們可以結(jié)合DAVID軟件對(duì)所選靶基因進(jìn)行 GO分析或通路分析，來針對(duì)某一特定功 能方面進(jìn)行靶基因的選擇。預(yù)測(cè)方法網(wǎng)址檢索范圍算法特點(diǎn)miRanda人，果蠅，斑馬魚序列匹配，雙鏈結(jié)合自由能，物種間保守性TargetScan/ TargetScanS人，小鼠， 大鼠，狗提出“ miRNA中子區(qū)”的概念RNAhybrid哺乳動(dòng)物快速準(zhǔn)確計(jì)算miRNA-mRN二聚體自由能DIANA- microT人，小鼠， 大鼠，果蠅考慮miRN/調(diào)控單個(gè)靶位點(diǎn)的情況PicTar脊椎動(dòng)物區(qū)分“完全匹配種子區(qū)”與“不完全匹配種

13、子區(qū)”RNA22哺乳動(dòng)物不考慮保守性，由mRN入手預(yù)測(cè)相關(guān)miRNA2.生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測(cè) miRN/靶基因時(shí)存在一定的局限性，因此很多醫(yī)學(xué)科研 人員也希望能夠利用生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法直觀地尋找miRN/靶基因。(1) 從mRN水平尋找miRN/靶基因一種方法是將miRNA莫擬物或過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使得miRNA在細(xì)胞中過表達(dá)，之后利用基因芯片分析mRN的變化以找出相應(yīng) miRNA勺靶基因。此外，Beitz in ger等人利用AGOt白家族既能結(jié)合 miRNAi能結(jié)合mRN的特性，分別使用 AGO-1和AGO-2蛋白的單克隆抗體在人類細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀，得到與AGO-1和A

14、GO-2蛋白結(jié)合的mRN各600條，并通過克隆測(cè)序?qū)@些 mRN進(jìn)行鑒定。同時(shí)從與 AGO-1蛋白結(jié)合的mRN中隨機(jī)挑選6條進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中有5條都是miRNA勺靶基因。EasoW等人也是利用純化 miRN來分析miRNA勺靶基因。他們 利用基因芯片分析了 miRNP吉合的mRN后發(fā)現(xiàn)，大量計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的miRN/靶基因得到了富集，同時(shí)為了分析單個(gè)miRNA勺靶基因，對(duì)野生型果蠅和miR-1缺失果蠅的miRNP吉合mRN進(jìn)行了分析，得到并利用實(shí)驗(yàn)方法鑒定miR-1調(diào)節(jié)的mRN，為miRNA靶基因的尋找提供了新的思路。最近，Liu等人在研究Mir-16家族的功能時(shí)建立了一種針對(duì)m

15、iRNAE基因的反向篩選法。首先，確定了感興趣的基因ccnd1,將它的3 UTR勾建到熒光素酶報(bào)告載體中，之后與構(gòu)建的miRNA表達(dá)文庫共轉(zhuǎn)染HepG2ffl胞，得到熒光值明顯下降的 miRNA再將得到的miRNA在體內(nèi)驗(yàn)證其功能，最終得 到Mir-16家族能夠調(diào)節(jié)CCND基因。該方法的關(guān)鍵在于，利用了自行構(gòu)建的miRNA表達(dá)文庫，能夠方便同時(shí)研究多條miRNA通過體外實(shí)驗(yàn)對(duì)候選 miRNAS行初步篩選，從而快速地鑒定一條 mRN所對(duì)應(yīng)的多條miRNA(2) 從蛋白質(zhì)水平尋找miRN/靶基因Selbach和Baek兩個(gè)研究組分別利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，建立了從蛋白質(zhì) 水平尋找miRNA靶基因

16、的新方法。兩個(gè)課題組分別將成熟miRNA雙鏈轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,利 用 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 穩(wěn) 定 同位 素 標(biāo) 記 技 術(shù)（stableisotopelabeli ngwitham ino acids in cellculture），將轉(zhuǎn)染了成熟 miRNA雙鏈的細(xì)胞和正常細(xì)胞分別培養(yǎng)于含輕 / 重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記必需氨基酸的培養(yǎng)基中， 經(jīng)過若干次細(xì)胞倍增后，穩(wěn)定同位素按照序列特異的方式完全摻入到新合成的蛋 白質(zhì)中，通過比較標(biāo)記前后同一肽段的質(zhì)譜峰值變化實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的精確定量。 在檢測(cè)了 20005000個(gè)蛋白后，兩個(gè)研究組分別發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染一條miRNA后有幾百個(gè)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了改變，許多改變?cè)?/p>

17、mRN水平上不能得到體現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究方法的引入，使得人們可以從蛋白質(zhì)水平上尋找miRNA勺靶基因，從而提高了靶基因的檢出率。三、miRNA靶基因的驗(yàn)證與miRNA靶基因的預(yù)測(cè)方法相比，對(duì) miRNA靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法 并不多，目前還沒有一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、高通量的鑒定方法。最直接的鑒定方 法是，利用熒光定量 PCR及Westernblot方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染或敲低 miRNA后 細(xì)胞中mRN/水平及蛋白水平的變化，從而確定miRNA與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這種方法能夠直接鑒定出miRNA的靶基因，準(zhǔn)確度高但不能鑒定 miRNA的靶位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染或敲低miRNA方式主要有兩種，一種是構(gòu)建 miRN

18、A過表達(dá)載體的穩(wěn) 定表達(dá)系統(tǒng)，一種是人工合成miRNA類似物的瞬時(shí)表達(dá)方式。miRNA的過表達(dá)載體中有插入成熟 miRNA、pre-miRNA 及 pri-miRNA 序列三種形式。其中 pri- miRNA（含側(cè)翼序列）的方式由于保留了每個(gè) microRNA獨(dú)自的原始天然雙臂 結(jié)構(gòu)，效果更好，是應(yīng)用最為廣泛的方法。microRNA過表達(dá)系統(tǒng)中有 CMV啟動(dòng)子（ II 型啟動(dòng)子）和 H1 啟動(dòng)子（ III 型啟動(dòng)子）兩種方式供選擇。 III 型 啟動(dòng)子（ H1、U6 等）具有表達(dá)效率高、有效的確定終止位置等優(yōu)點(diǎn)，成為首 選。II型啟動(dòng)子適用于pri-miRNA序列中有連續(xù)的5個(gè)T-導(dǎo)致III型

19、啟動(dòng)子 （ CMV、Ubi 等）終止轉(zhuǎn)錄的情況。載體系統(tǒng)也分多種，包括慢病毒載體、腺 病毒載體、質(zhì)粒載體等。瞬時(shí)過表達(dá)方式主要是經(jīng)過人工化學(xué)修飾的運(yùn)用化 學(xué)方法合成的雙鏈RNA能模擬細(xì)胞中內(nèi)源性成熟 miRNA的高水平表達(dá)，以增 強(qiáng)內(nèi)源性 miRNA的調(diào)控作用，進(jìn)行功能獲得性研究。只需直接轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞， 即可檢測(cè)功能變化，快速，方便。miRNA靶位點(diǎn)鑒定：目前最為常用的miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報(bào)告基因法。其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體，將希望鑒定的 miRNA 靶基因的3 UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的 3 UTR中，之后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn) 染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平，最后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3 UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn)。近幾年來，對(duì) miRNA的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域中的一個(gè)重要方向。越來越