群體感應(yīng)信號(hào)分子AHLs降解酶研究進(jìn)展(代)

1、AHLs信號(hào)分子降解酶的研究進(jìn)展魏金亞 摘 要：群體感應(yīng)（Quorum-sensing system, QS）是原核生物和真核生物中與細(xì)胞群體密度相關(guān)的通訊機(jī)制，參與許多生物學(xué)功能的調(diào)控。?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine laetone)AHLs)是調(diào)控QS系統(tǒng)的關(guān)鍵信號(hào)分子。通過限制AHLs的濃度來調(diào)控與QS相關(guān)的生物學(xué)功能在理論和實(shí)踐上具有重要意義。本文從AHLs信號(hào)分子的降解為入口，簡(jiǎn)要概述了AHLs降解酶的種類、特點(diǎn)特性、生物學(xué)功能，并對(duì)其在生防和藥理學(xué)上的應(yīng)用進(jìn)行了綜述和展望。關(guān)鍵詞：群體感應(yīng) AHLs 抑制 AHL-內(nèi)酯酶 AHL-酰化酶 AiiA AttM群體效

2、應(yīng)（Quorum-sensing system，QS）普遍存在原核生物之間和原核生物與真核生物之間，即細(xì)菌感知周圍環(huán)境同種細(xì)胞密度調(diào)節(jié)其基因表達(dá)的現(xiàn)象。AHLs是G-細(xì)菌進(jìn)行群體效應(yīng)胞間通訊的關(guān)鍵因素，細(xì)菌通過感知這種信號(hào)分子來感知細(xì)胞密度的閾值。AHLs能夠引發(fā)大量與細(xì)胞密度或生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)的反應(yīng)，如生物發(fā)光，抗生素合成、細(xì)胞游動(dòng)和聚集、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移、生物膜維持和分化、胞外酶合成及人和高等植物致病毒力產(chǎn)生等等1-3。目前已經(jīng)從一些原核生物和真核生物中鑒定出一些群體感應(yīng)降解酶，這些降解酶可能降解細(xì)菌QS系統(tǒng)的信號(hào)分子AHLs，干擾細(xì)菌QS系統(tǒng)，抑制致病基因的誘導(dǎo)表達(dá)，破壞其參與調(diào)控的生物學(xué)功能。

3、在農(nóng)業(yè)(防治植物病害)、醫(yī)學(xué)（以QS系統(tǒng)的調(diào)控位點(diǎn)作為靶位來篩選抗藥性物質(zhì)）、環(huán)保(藍(lán)藻水華)等研究方面具有重要意義。AHLs降解酶的種類、特點(diǎn)特性、生物學(xué)功能、作用機(jī)制以及在生防和藥理學(xué)上的應(yīng)用前景等幾個(gè)方面的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。1 AHLs降解酶種類研究結(jié)果表明，許多動(dòng)物（包括人類）和植物中的病原細(xì)菌如玉米細(xì)菌性枯萎病菌、菊歐文氏菌、嗜線蟲致病桿菌、銅綠假單胞菌和歐文氏胡蘿卜軟腐病菌等都是依賴AHLs信號(hào)分子來實(shí)現(xiàn)對(duì)其致病因子的合成7-12。在原核生物以及真核生物中都存在著具有活性的AHL降解酶。目前研究比較多的是兩類AHLs降解酶：AHL-內(nèi)酯酶(AHL-1actonase)和AHL-酰

4、化酶(AHL-acylase)。AHLs內(nèi)酯酶是最早在原核生物當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的，能夠破壞AHLs信號(hào)分子并使其失活的一種降解酶，也被稱為群體感應(yīng)淬滅酶，由aiiA基因編碼。最早從革蘭氏陽性菌芽抱桿菌240B1中克隆得到4，現(xiàn)已從蘇云金芽孢桿（Bacillu thuringiensis，Bt）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）等中成功擴(kuò)增出了aiiA基因，并對(duì)aiiA基因的融合表達(dá)、AiiA蛋白結(jié)構(gòu)及抗菌作用做了進(jìn)一步的研究5-8,12,29，該酶廣泛存在于土壤真菌中，獲得比較容易，應(yīng)用前景較好。AHL酰化酶也能夠降解AHL

5、s信號(hào)分子，且能使其徹底喪失生物活性。但這種酶由于不廣泛存在，目前對(duì)它的研究并不是很多。例如在假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的AHL酰化酶，能夠降解長(zhǎng)鏈信號(hào)分子并使其失活4。在其突變株中還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)編碼AHLs?；D(zhuǎn)移酶的基因quiP，不過這個(gè)基因的協(xié)調(diào)方式目前還不清楚9。目前在真核生物中發(fā)現(xiàn)三種AHLs信號(hào)分子降解酶。一種是Greenberg等在動(dòng)物的細(xì)胞中檢測(cè)到的酶，能夠降解AHLs信號(hào)分子致其失活18；一種是豬腎臟中的?；D(zhuǎn)移酶18；第三種酶是在植物中發(fā)現(xiàn)的指狀巖褐藻產(chǎn)生的鹵素過氧化物酶，它能夠催化產(chǎn)生鹵素氧化物，從而破壞AHLs信號(hào)分子10。近幾年也有新進(jìn)展，例如邱健等首次篩選到一株能夠降解AHL的

6、酵母菌,經(jīng)鑒定為紅冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)這一發(fā)現(xiàn)豐富了群體感應(yīng)淬滅酶的來源11 。2 AHL降解酶的作用機(jī)制和特性目前研究發(fā)現(xiàn)兩種作用機(jī)制,第一種是AHL-內(nèi)酯酶能水解AHL內(nèi)酯鍵,產(chǎn)生活性較低的酰基高絲氨酸；研究發(fā)現(xiàn)該酶具有同許多金屬酶類相似但略有不同的保守結(jié)構(gòu)HXHXDH12-14 。Uroz等人最新報(bào)道了一種新的作用機(jī)制，從R.erythropolis菌中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的降解AHLs信號(hào)分子的酶（qsdA），該基因編碼的是Phosphotriesterase（磷酸三酯酶），其作用方式和內(nèi)酯酶相似，但其分解AHLs的能力具有菌專一性15另一種是AHL-酰

7、化酶可以水解AHL酰胺鍵，產(chǎn)生無活性的高絲氨酸內(nèi)酯和脂肪酸，為不可逆反應(yīng)，且脂肪酸可以被細(xì)菌進(jìn)一步利用16（圖）。對(duì)于AHL?；傅拿复呋瘷C(jī)制和底物特異性相關(guān)報(bào)道還不是很多。例如從羅爾斯頓菌（Ralstonia sp.) 中得到的由aiiD編碼的AHL?；D(zhuǎn)移酶可以將AHLs信號(hào)分子水解為內(nèi)酯環(huán)和酰氨鏈16。圖 AHLs信號(hào)分子降解兩條途徑示意圖3 AHLs生物學(xué)功能在自然界中，有很多微生物能夠產(chǎn)生AHLs信號(hào)分子降解酶16,17,18。現(xiàn)在，有越來越多的證據(jù)顯示，AHLs信號(hào)分子降解酶參與著微生物之間的相互作用，并調(diào)控著微生物的生理習(xí)性等。蘇云金芽孢桿菌能夠通過產(chǎn)生AHLs內(nèi)酯酶，能抑制植物

8、病原菌致病因子的表達(dá)。產(chǎn)生AHLs內(nèi)酯酶的蘇云金芽孢桿菌可以有效地抑制歐文氏胡蘿卜軟腐病菌的細(xì)胞在植物組織中的擴(kuò)散，但并不影響自身生長(zhǎng)。表達(dá)AiiA的轉(zhuǎn)基因植物可以降解致病菌QS系統(tǒng)的信號(hào)分子，明顯增強(qiáng)了對(duì)胡蘿卜歐文氏菌感染的抗性。而aiiA基因的突變株則不能阻止病原菌的群體感應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致致病原菌的迅速擴(kuò)散。這些結(jié)果表明，AHLs內(nèi)酯酶影響著微生物不同種群之間的信號(hào)交流及相互作用，可以提高其產(chǎn)生菌的環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)力。Wopperer等人19發(fā)現(xiàn)在表達(dá)aiiA 基因的不同種伯克霍爾德菌(Burkholderia sp.)菌株中，大部分菌株生物膜內(nèi)細(xì)菌生物量降低，只有少數(shù)菌株膜內(nèi)細(xì)菌生物量增加或

9、無變化，暗示AiiA對(duì)生物膜形成的抑制作用比較廣范。07年王瑤等人將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因克隆至Pseudomonas/E.coli穿梭載體并轉(zhuǎn)入銅綠假單胞菌PAO1菌株，通過檢測(cè)信號(hào)分子和重要毒力因子，以及對(duì)叢集運(yùn)動(dòng)、生物膜形成和結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)不僅能夠降低毒力因子的表達(dá)，而且能夠影響生物膜的形成和分散20。Romero等研究發(fā)現(xiàn)，魚腥藻（Anabaena sp.）PCC120其細(xì)胞群體存在AHLs濃度調(diào)節(jié)機(jī)制，分離得到具有AHL降解活性的aiiC基因，屬于?；D(zhuǎn)移酶21，在藍(lán)藻基因組中也發(fā)現(xiàn)了這種?；D(zhuǎn)移酶的同源序列，并證實(shí)廣泛存在21，說明aiiC基因除了在藍(lán)藻中參與A

10、HL濃度的自我調(diào)節(jié)外，還可能作為一種避免外來信號(hào)干擾的自身信號(hào)系統(tǒng)的屏障。4 AHLs降解酶在生防和藥理學(xué)上的應(yīng)用研究 目前總結(jié)主要從兩個(gè)方面防治動(dòng)植物病害，一種是利用合成內(nèi)酯酶的細(xì)菌或攜帶外源AHLs內(nèi)酯酶的工程菌。比如：Molina將aiiA導(dǎo)入熒光假單胞菌( Pseudomonas fluorescens ) P3構(gòu)建生物防治工程菌株，其產(chǎn)生的內(nèi)酯酶AiiA，不但可以防治馬鈴薯軟腐病的發(fā)生，而且對(duì)其還具有一定的治療效果22。宋水山等從兩株蘇云金芽胞桿菌的基因組DNA中克隆到2個(gè)aiiA基因ss1和ss1023。酶學(xué)特性研究表明SS10蛋白具有廣譜的底物特異性；在馬鈴薯軟腐病的抗病實(shí)驗(yàn)中，

11、不論是純化的AHL內(nèi)酯酶24，還是重新構(gòu)建的重組熒光假單胞菌25，均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。表達(dá)aiiA基因的轉(zhuǎn)基因魔芋葉片的蛋白可以降解信號(hào)分子26；表達(dá)aac基因的煙草在抗病性研究中，與對(duì)照相比達(dá)到中等抗性水平27；一種是獲得轉(zhuǎn)基因植物。比如：Dong等證實(shí)源于Bacillus sp.的aiiA基因?qū)腭R鈴薯，獲得轉(zhuǎn)基因植株，其產(chǎn)生的內(nèi)酯酶AiiA能降解馬鈴薯軟腐病菌的群體感應(yīng)信號(hào)分子AHLs，抑制馬鈴薯軟腐病的發(fā)生28。馬宏等aiiA置于CaMV35S啟動(dòng)子下構(gòu)建雙元載體，利用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥（Arabidopsis thali

12、ana），通過抗性篩選和分離獲得純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。PCR及RT-PCR分析表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中整合并表達(dá)這些研究表明，將抑制信號(hào)分子的基因轉(zhuǎn)化植物，獲得的轉(zhuǎn)基因植物是可以破壞群體感應(yīng)，從而減弱病害程度，達(dá)到生物防治的效果29。谷春艷將attM導(dǎo)入大腸桿菌后，經(jīng)與胡蘿卜軟腐果膠桿菌混合，接種彩色馬蹄蓮，對(duì)病原菌的生長(zhǎng)幾乎沒有影響，但抑制了其致病性30。其功能與當(dāng)前國(guó)際植物病理界研究熱點(diǎn)的aiiA基因相似。AHLs降解酶在藥理學(xué)方面的研究報(bào)道并不多，但其在醫(yī)學(xué)界的前景是肯定的。目前將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因轉(zhuǎn)入可引起呼吸道感染、敗血癥、骨髓炎、心內(nèi)膜炎和尿路感染等疾病的銅綠假單胞

13、菌PAO1菌株中，影響了生物膜的形成，降低了毒力因子的表達(dá)20。細(xì)菌生物膜的形成可使細(xì)菌逃逸抗菌藥物和機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，這說明將降解基因轉(zhuǎn)入人或動(dòng)物當(dāng)中降解致病性是可行的，為解決臨床治療細(xì)菌感染奠定了基礎(chǔ)。3 結(jié)語通過采用一種降解致病菌產(chǎn)生的AHLs信號(hào)分子的方法來控制細(xì)菌侵染逐漸成為一種新的研究趨勢(shì)。細(xì)菌的群體感應(yīng)降解酶為生物防治群體感應(yīng)依賴型的細(xì)菌侵染提供了可能的途徑，但當(dāng)中也存在不足，比如一些酶的作用機(jī)制還不太清楚，還有轉(zhuǎn)基因植物是否對(duì)人體產(chǎn)生其他的影響，尚且不太清楚，目前對(duì)AttM基因簇的研究不太多，將降解酶轉(zhuǎn)入人或動(dòng)物當(dāng)中的報(bào)道還不太多。李老師：由于對(duì)分子方面了解

14、甚少，通過閱讀文獻(xiàn)也沒能在結(jié)語處寫出新的觀點(diǎn)。李老師你幫我看看，看能不能就咱們最近的實(shí)驗(yàn)提出一個(gè)關(guān)于此酶在藍(lán)藻當(dāng)中的研究方向。你先看看吧！參考文獻(xiàn)：.2001,55:165-199.2Swift S.Downie J.A. Whitehead N.A. et al. Quorum sensing as a population-density-dependent determinant of bacterial physiology.Adv.Microbial Physiol.2001,45:199-270.3Whitehead NA,Barnard AML.,Slater H., et al

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