如何利用BLAST分析驗證引物序列

1、如何利用BLAST分析驗證引物序列引物設(shè)計完成之后，需要用軟件進(jìn)行分析，找到最佳的引物對，采用 Blast分析驗證引物，可以知道序列的正確性，也能知道引物的特異性狀況、引物的具體位置以及PCR產(chǎn)物的大小。 先找到需要設(shè)計引物的目標(biāo)基也固有引物序列的mRNA序列，可以通過全文(如最先發(fā)現(xiàn)該基因的文章)，全文中有時可以找到大鼠 c-jun mRNA 序列的ACCESSION NUMBER ,在 PubMed 中的 “Nucleotide ” 中用此 ACCESSION NUMBER 就能找到序 列。 可以利用這個 ACCESSION NUMBER 在PubMed 中的“ Nucleotide ”中

2、搜索到序列 后，點擊右邊的"Links”,再點擊里面的“Related Sequences ”就能找到所有的大鼠 c-jun mRNA 序列及其他物種的一些c-jun mRNA 序列。文獻(xiàn)中的引物最好先驗證其序列正確，并用軟件分析引物比較好后再采用。通過 BLAST驗證，既可知道序列是否正確，也可同時了解引物的特異性、引物的位置及PCR產(chǎn)物的大小等。 如果僅僅是為了驗證引物序列是否正確(僅適合于基于完全匹配原則設(shè)計的引物)，也可 以用 Blast 的"Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn )”或“ Search for short, nea

3、rly"或"Search for short,exact matches ”搜索，具體方法為： 1.打開 Blast ,點擊“Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) nearly exact matches2 .等新頁面完全顯示后，將引物序列直接 copy到“Search ”框(沒有必要將下游引物序 列轉(zhuǎn)換成其互補(bǔ)鏈)，下面 3種方法都可以(我覺得 3種方法的搜索結(jié)果沒什么區(qū)別，沒 仔細(xì)比較過哦！)(1)直接拷貝上游引物序列，然后直接將下游引物序列拷貝在上游引物后面(2)直接拷貝上游引物序列，在上游引物序列后加一空格，然后直接將下游引物序列

4、拷貝在空格后面(3)直接拷貝上游引物序列，換行，然后直接拷貝下游引物序列注意：記住上、下游引物的長度，如上游引物為19bp、下游引物為18bp ,這在查看Blast結(jié)果時有用。3 .點擊“BLAST!: 新頁面完全出來以后，點擊“ Format !”。4 .結(jié)果完全出來后，查找有沒有和1-19、20-37同時完全匹配的基因，其他的就不用考慮了。當(dāng)然，如果下游引物序列所對應(yīng)的基因片段的3'端正好和上游引物序列的3'端的1或2個堿基互補(bǔ)，那就可能是19-37或18-37 。如果有，那你的引物序列就是正確的。從文獻(xiàn)上查的引物，除了要用Blast驗證其序列是否正確外，還是應(yīng)該用軟件分析

5、分析到底引物好不好。實例1、進(jìn)入網(wǎng)頁：http:/www.NCBI ./BLAST/2、點擊 Search for short, nearly exact matchesNucleotide Quick? search fcn hhly similar sequences Qulddy search far dvergent sequences(difcontigjous negablast) Nudeotidenuc3tkfe BLASUfefestnartjivdMontjciuq me單bla4Translated Traiislated query roter d

6、t5base (blastx)3、在search欄中輸入引物系列:注：文獻(xiàn)報道 ABCG2的引物為 5 ' -CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3 'blast 程5 ' -TGCCCATCACAACATCATCT-3 '(1)輸入方法可先輸入上游引物，進(jìn)行 blast程序，同樣方法在進(jìn)行下游引物的序。這種方法較繁瑣，而且在結(jié)果分析特異性時要看能與上游引物的匹配的系列，還要看與 游引物匹配的系列一一之后看兩者的交叉。CT15AGATC 佇 TAGC C TTTGGTo匚 hn口s 中 dfltjhAar(2)簡便的做法是同時輸入上下游引物：有以下兩種方法

7、。輸入上下游引物系列都從5'3 oA、輸入上游引物空格 輸入下游引物B、輸入上游引物回車輸入下游引物4、 在 options for advanced blasting中：select from欄選擇 Homo sapiensORGN , Expect后面的數(shù)字改為105、在 format 中：select from 欄選擇 Homo sapiens【ORGN , Expect 后面的數(shù)字填上0 10。fFonnat部。吐 BGraphicd Overview /LmMulIZ %里加.RrtrievM BNCBhgj AlignmentCDSM型kinRCh即Mief Lower C

8、ase" M弟岫咳Cokr GrgySemkauto 76、點擊網(wǎng)頁中最下面的“ BLAST!7、AulofoTtnJit S?mi-£)uta Get the UKL with preset values ?出現(xiàn)新的網(wǎng)頁，點擊Format!Ycur request has sutctssfiiHy submitted and put int<> tht Blast QueutQueiy = (40 lerttrs)Ycur search w於 limited by an Entrei qutry; Homo sapiens ORGNTtie request I

9、D1166094202-1762S-88962626090 BLASTSrormatiThs results ue eclimated to be r»ady in 15 seconds but may be done soontr.8、等待若干秒之后，出現(xiàn) results of BLAST 的網(wǎng)頁。該網(wǎng)頁用三種形式來顯示blast的結(jié)果。(1)圖形格式:Disciibtifion of 95 B】通北 Hhi 出口 th沙 Quk y l¥qiHiiurMoue-over to define and scores, dick lo show tlignmemts圖中代表這

10、些序列與上游引物匹配、并與下游引物互補(bǔ)的得分值都位于4050分圖中代表這些序列與上游引物匹配的得分值位于4050分，而與下游引物不互補(bǔ)圖中代表這些序列與下游引物互補(bǔ)的得分值小于40分，而與上游引物不匹配通過點擊相應(yīng)的bar可以得到匹配情況的詳細(xì)信息。HowATP-tinding cwsttt.Sequences producing Jlqinificanc alignnentj:2E2S0埼JCEINNan 口 54n?70i 址 iggg64g7.i百對11丁7，”3幻皿酒5叩？._11目2| 自23 LlZCjgh口,二 |Score (Bita)(2)結(jié)果信息概要:Homo a ftp

11、lens ATP-bihtling cassette.Hob» sapiens clone rLHlS5G81.DIL;.Homo sapiens clot# JAR Ele 5 1ECG2.- -42從左到右分別為：A、數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點擊之后可以獲得該序列的信息B、系列的簡單描述C、高比值片段對(high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的計算公式=匹配的堿基x 2+0.1 。舉例：如果有 20個堿基匹配，則其得分為40.1。D、E值：代表被比對的兩個序列不相關(guān)的可能性。 The E value decreas

12、esexponentially as the Score (S) that is assigned to a match between two sequencesincreases。E值最低的最有意義，也就是說序列的相似性最大。設(shè)定的 E值是我們限定 的上限，E值太高的就不顯示了E、最后一欄有的有 UEG的字樣，其中：U代表：Unigene數(shù)據(jù)庫E代表：GEO profiles 數(shù)據(jù)庫G代表：Gene數(shù)據(jù)庫結(jié)果詳細(xì)信息： 圈出來的部分代表序列的信息 第一個大括號代表上游引物與該序列的正鏈【 Plus/Plus 的匹配情況:共有21個堿基匹配，得分 42.1分21 X2+0.1=42.1 ,

13、E值為0.020上游引物與序列的 21432163位點匹配第二個大括號代表下游引物與該序列的負(fù)鏈【 Plus/Minus 的匹配情況：共有20個堿基匹配，得分 40.1分20 X2+0.1=40.1 , E值為0.077。下游引物與該序列的 2936029379位點互補(bǔ)注意點：上游引物為20個堿基，為什么會變成 21個堿基呢？這是因為下游引物的第一個堿基為T,剛好與系列的2163位點的T匹配，因此下游引物的開頭的第一個堿基被當(dāng)成了上游引物了。同理，上游引物的最后一個堿基為G,被當(dāng)成了下游引物了。通過尋找有沒有與120位點、2040位點完全匹配的序列，就可以避免這個因素的干擾了。為什么與上下游引物匹配的ABCG2序列有多種A、為同一個基因來源的不同的mRNA片段B、 為該基因的DNA系列C、為同一個基因來源的不同的