泡桐花總黃酮抗哮喘豚鼠氣道炎癥的作用機制探討(一)

1、泡桐花總黃酮抗哮喘豚鼠氣道炎癥的作用機制探討(一)    作者：陳保紅， 李寅超， 趙宜紅， 傅蔓華 【關鍵詞】 豚鼠；,慢性氣道變應性炎癥；,泡桐花總黃酮摘要：目的通過豚鼠哮喘模型研究泡桐花總黃酮抗哮喘氣道變應性炎癥的作用。 方法以卵蛋白（OA）致敏豚鼠為動物模型，灌胃途徑予以泡桐花總黃酮大、小劑量，觀察各組豚鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞（EOS）數(shù)和嗜酸性粒細胞特異性趨化因子（Eotaxin）的改變。結(jié)果泡桐花總黃酮可顯著延長致敏豚鼠的引喘潛伏期，不同程度地抑制BALF中的EOS和白細胞總數(shù)及氣道上皮Eotaxin的過度表

2、達。 結(jié)論泡桐花總黃酮對哮喘具有一定的保護作用，其中泡桐花總黃酮可能通過調(diào)控Eotaxin在氣道黏膜上皮的過度表達，進而抑制Eos向哮喘氣道的募集，消除氣道炎癥，成為其發(fā)揮抗過敏性哮喘的重要環(huán)節(jié)。關鍵詞：豚鼠； 慢性氣道變應性炎癥； 泡桐花總黃酮Abstract：ObjectiveThis study was designed to investigate the effects of flavonoids in Fructus Paulowniae on IAR and LAR.MethodsAn guinea pig asthmatic model, induced by OVA was

3、administered by intragastric gavage(ig) with different doses of flavonoids in Fructus Paulowniae. The latent period, the number of acidophils and the Eotaxin in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were observed. ResultsThe flavonoids in Fructus Paulowniae could delay the latent period of airway infla

4、mmation significantly. The number of acidophils and total white blood cell in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was restrained by flavonoids in Fructus Paulowniae. In addition, the flavonoids in Fructus Paulowniae could inhibit the overexpression of Eotaxin in the trachea epithelium.ConclusionThe r

5、esults suggest that flavonoids in Fructus Paulowniae can antagonize airway inflammation by inhibiting the overexpression of the Eotaxin in trachea epithelium.Key words：Paulounia fortunei(Semsl.)Hemsl; Flavonoids; Bronchia asthma 氣道炎癥是支氣管哮喘(asthma)的病理基礎，有多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子參與其炎癥過程1。研究發(fā)現(xiàn)2嗜酸性粒細胞（EOS）趨化聚集，

6、在氣道炎癥的形成過程中起重要作用，Eotaxin是EOS的選擇性趨化劑3，也是EOS在哮喘發(fā)病過程中選擇性增加的原因。因此，調(diào)控Eotaxin的過度表達，抑制EOS在氣道內(nèi)的募集，消除氣道炎癥，對治療哮喘具有關鍵性意義。根據(jù)文獻報道4，5，少常用草藥泡桐花在支氣管哮喘的臨床治療上具有一定的效果；泡桐花浸膏能夠明顯改善哮喘豚鼠肺組織的病理損傷，對哮喘豚鼠有顯著的治療作用；泡桐花主要成分6為揮發(fā)油、總黃酮、熊果酸等，其中總黃酮含量較豐富（3.081%）。我們以泡桐花總黃酮為研究對象，采用ig給藥途徑，結(jié)合圖象分析技術探討其抗哮喘作用及其機制。1 材料與方法 1.1 動物與分組健康白化豚鼠，雌雄各半

7、，體重（200±50）g，由河南省實驗動物中心提供。隨機分為模型、陽性、空白對照組和泡桐花總黃酮大、小劑量組。10只/組。1.2 藥品與試劑卵白蛋白（ovalbumin，OA）：Sigma公司，Grade；Eotaxin一抗(BA1469，Rabbit anti-Eotaxin)武漢博士德生物工程有限公司，相應二抗試劑盒及陽性對照片購自北京中山生物技術有限公司；醋酸地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號051247。泡桐花總黃酮由鄭州大學藥學院生藥學研究室提供。1.3 動物誘喘及用藥參照宮兆華7方法，常規(guī)飼養(yǎng)觀察3 d無異常后，予10OA生理鹽水(N.S)溶液200 mg/kg

8、ip致敏，并于當天開始按表1劑量給藥。第15天時，予5%OA的N.S溶液霧化吸入誘導哮喘發(fā)作。用哮喘發(fā)作（動物取出后的表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、煩躁、抽搐、跌倒甚至死亡)的動物進行實驗。1.4 用藥過程中哮喘防治作用觀察用藥第5，12天及第15天，3次對豚鼠進行激發(fā)實驗。予5%OA的N.S溶液霧化吸入激發(fā)10 s，封閉時間共20 s，觀察記錄各組動物哮喘嚴重程度，取第15天的引喘潛伏期（自霧化開始至豚鼠腹肌痙攣、腹部凹陷出現(xiàn)的時間作為引喘潛伏期，超過6 min者以360 s計算）為統(tǒng)計指標。在第5，12天的激發(fā)過程中，先后有8只動物（大、小劑量組各2只，模型組3只，陽性組1只）因反應劇烈，搶救不及

9、而窒息死亡。1.5 BALF（broncho alveolar lavag fluid BALF）的采集與細胞計數(shù)暴露豚鼠氣管肺，用絲線結(jié)扎右肺門處，行氣管插管灌洗左肺。灌入N.S 5 ml（抽吸2次）×2次，灌洗回收率大于80%，無菌離心（1 500 r/min×10 min），沉淀細胞以Hanks液處理后即刻在顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù)，細胞濃度調(diào)至2×106/ml，涂片，瑞氏染色，計數(shù)白細胞總數(shù)和EOS數(shù)。1.6 免疫組化Eotaxin檢測摘取右肺中葉，放入乙醇、醋酸和甲醛混合固定液中固定48 h。石蠟切片（4 m×3張）脫蠟至水，行免疫組化Eotaxi

10、n（EOS趨化性細胞因子）染色。免疫組化操作按說明書進行，DAB顯色。另設不加一抗的切片作陰性對照。每只動物在細支氣管黏膜各隨機選擇5個Hot視野，計算機圖像分析系統(tǒng)檢測每個Hot視野Eotaxin表達陽性信號的積分光密度IOD，以平均值表示該動物氣道Eotaxin陽性表達水平。1.7 統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)以 ±s表示，使用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析。2 結(jié)果表1 泡桐花總黃酮對豚鼠引喘潛伏期的影響（略）與模型對照組比較，*P0.05， *P0.012.2 對BALF中白細胞總數(shù)與EOS計數(shù)的影響結(jié)果表明，泡桐花總黃酮大劑量和陽性藥對BALF中白細胞總數(shù)和EOS計數(shù)有抑制作用，與

11、模型組比較，差異有極顯著性意義（P0.01）。結(jié)果見表2。表2 對BALF中白細胞總數(shù)與EOS計數(shù)的影響（略）與模型對照組比較，*P0.05，*P0.012.3 豚鼠氣道上皮表達Eotaxin陽性蛋白信號的圖象分析鏡下Eotmin陽性信號主要位于支氣管黏膜上皮、肺泡上皮和平滑肌細胞、肺微血管內(nèi)皮細胞胞漿，內(nèi)含棕黃色顆粒物質(zhì)。圖象分析結(jié)果顯示，模型組支氣管黏膜上皮Eotaxin表達陽性信號的IOD顯著高于空白組，差異有顯著性意義（P均0.01）；與模型組比較，陽性藥和總黃酮大劑量組表達Eotmin陽性蛋白信號細胞的IOD明顯降低，差異有顯著性意義（P0.05）。結(jié)果見表3。表3 對豚鼠氣道Eot

12、axin 陽性細胞數(shù)量的影響 （略）與模型對照組比較，*P0.05,*P0.013 討論哮喘(asthma)是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應和氣道炎癥為特征的免疫變態(tài)反應性疾病1，2。慢性氣道炎癥是哮喘發(fā)病的一個重要因素，有多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)和細胞因子參與其炎癥過程。氣道炎癥是氣道高反應(Bronchial Hyperresponsiveness，BHR)的基礎，無論過敏性還是非過敏性哮喘，氣道炎癥都以Eos的浸潤募集和激活為最終途徑，而哮喘時異常高表達于氣道上皮的Eotaxin作為EOS高度選擇性的化學趨化劑，成為EOS在哮喘發(fā)病過程中選擇性增加的原因2。研究發(fā)現(xiàn)，浸潤

13、于哮喘模型動物細支氣管黏膜的EOS數(shù)與該部位Eotaxin 陽性表達水平呈顯著正相關8。因此，調(diào)控Eotaxin的過度表達，抑制Eos在氣道內(nèi)的募集，消除氣道炎癥，對治療哮喘具有關鍵性意義。在哮喘的治療藥物中，甾體類抗炎藥糖皮質(zhì)激素等是目前較有效的藥物，但因其副作用多，不宜長期使用，導致哮喘的控制率不盡人意，死亡率較高1。中藥成分雖然復雜，但其具有整體調(diào)節(jié)且毒副作用相對較小的優(yōu)點，因此，從中藥中挖掘抗炎平喘成分是未來哮喘研究的重要內(nèi)容。本實驗以引喘潛伏期、EOS和Eotaxin作為觀察指標，探討泡桐花總黃酮抗支氣管哮喘變應性炎癥的防治作用及其可能的機制。實驗結(jié)果顯示，泡桐花總黃酮可顯著延長致敏

14、豚鼠的引喘潛伏期，不同程度地抑制BALF中的EOS和白細胞總數(shù)及氣道上皮Eotaxin的過度表達，與模型組比較有顯著差異。給藥5 d和12 d，泡桐花總黃酮大小劑量不能預防再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘發(fā)作，并且動物死亡率高，這很可能是動物對抗原敏感度高所致。給藥第15天，再次吸入卵蛋白抗原后的哮喘發(fā)作較平穩(wěn)，無死亡發(fā)生，可能與藥效發(fā)揮和免疫耐受有關。 本實驗結(jié)果表明，泡桐花總黃酮對哮喘具有一定的保護作用，其中泡桐花總黃酮可能通過調(diào)控Eotaxin在氣道黏膜上皮的過度表達，進而抑制Eos向哮喘氣道的募集，消除氣道炎癥，成為其發(fā)揮抗過敏性哮喘的重要環(huán)節(jié)。參考文獻：1 王國斌重視哮喘，正確診治和控制哮喘J.中原醫(yī)刊，2002，29（11）：40 2 Luis MTeran CCL Chemokines and asthmaJ.Immunology today，2000，21(5)：2353 劉 新，張 蘇，崔 毅豚鼠氣道炎癥中Eotaxin基因表達的意義J.微生物學雜志，2005，25（3）：33.4 全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：466.5 張永輝，劉宗花，杜紅麗，等中藥泡桐花浸膏對哮喘豚鼠肺組織作用的病理學研究J.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2002，19(6):473.6 王 曉，程傳格，劉建華.泡桐花精油化學成分分析J.林產(chǎn)化學與工業(yè)，2005，25