心肌α肌球蛋白重鏈啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1、心肌肌球蛋白重鏈啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定                                             

2、     關(guān)鍵詞】  心作者：潘國棟 黃永章， 郭凌鄖， 唐俊明， 孔 霞， YANG Qinglin， 王家寧 肌特異性；肌球蛋白重鏈；啟動子；增強型綠色熒光蛋白；干細(xì)胞        摘  要  目的： 構(gòu)建并鑒定心肌肌球蛋白重鏈啟動子驅(qū)動的綠色熒光蛋白表達(dá)載體（MHC-EGFP），該基因只在心肌中特異性表達(dá)。 方法： 設(shè)計5和3分別具有SalI/Hind酶切位點的EGFP引物，聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）從pLEGFP質(zhì)粒中擴增增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的cD

3、NA，插入pGEM-T Easy載體表達(dá)盒，構(gòu)建pGEM-EGFP，SalI/Hind雙酶切后回收729 kb片斷，插入經(jīng)相同酶切的含5.5 kb心肌特異性肌球蛋白重鏈啟動子的pNC26質(zhì)粒，構(gòu)建pMHC-EGFP。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5，挑選克隆，PCR擴增鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)NotI酶切，回收7.2 kb MHC-EGFP表達(dá)盒。分離培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞與骨骼肌成肌細(xì)胞。MHC-EGFP表達(dá)盒通過脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染心肌與骨骼肌成肌細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否出現(xiàn)綠色熒光，以鑒定MHC-EGFP表達(dá)盒是否具有表達(dá)特異性。結(jié)果： EGFP cDNA正確插入pNC26質(zhì)粒中MHC啟動子3端。成功轉(zhuǎn)染

4、MHC-EGFP表達(dá)盒的心肌細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，而轉(zhuǎn)染的骨骼肌成肌細(xì)胞無熒光出現(xiàn)。結(jié)論： MHC-EGFP表達(dá)盒具有心肌特異性表達(dá)特性，為進(jìn)一步監(jiān)測干細(xì)胞向心肌分化研究奠定基礎(chǔ)。    關(guān)鍵詞  心肌特異性；肌球蛋白重鏈；啟動子；增強型綠色熒光蛋白；干細(xì)胞    Abstract: Objective To construct and identify the cardiac  -myosin heavy chain promoter (MHC) -driven enhanced green fluorescent

5、protein (EGFP) expression vector (pMHC-EGFP), which solely expresses EGFP in cardiomyocytes. Methods EGFP cDNA primers were synthesized with forward primer and reverse primer containing SalI and Hind, respectively. EGFP cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR), added single deoxyadenosi

6、ne at 3 ends, and subcloned into pGEM-T easy vector to construct pGEM-EGFP. The fragment of 729 bp from SalI/Hind-digested pGEM-EGFP was subcloned into pNC26, a plasmid carried 5.5 kb MHC promoter, to construct pMHC-EGFP. The expression cassette of 7.2 kb MHC-EGFP was recovered with low melting poin

7、t agarose electrophoresis. Mouse cardiomyocytes and skeletal muscle myoblasts were isolated and cultured in vitro. MHC-EGFP expression cassette  was transfected into cardiomyocytes and myoblasts, respectively. EGFP expression was observed under fluorescent microscope. Results EGFP cDNA was succ

8、essfully inserted into the 3 ends of MHC promoter. The green fluorescence could be observed in transfected cardiomyocytes, but not in transfected myoblasts. Conclusion  MHC-EGFP expression cassette can be specifically expressed within cardiomyocytes, which provides a basis to monitor the differ

9、entiation of stem cells into cardiomyocytes.    Key words:Cardiac-specific; Myosin heavy chain; Promoter; Enhanced green fluorescent protein; Stem cells   近年來日益興起的大量干細(xì)胞研究證實，胚胎或成體間充質(zhì)干細(xì)胞在一定條件下可以分化為心肌樣細(xì)胞，為心臟疾病的治療帶來了希望。然而這些心肌樣分化的干細(xì)胞是否具有成年心肌的收縮和傳導(dǎo)功能，目前研究還相當(dāng)缺乏。這是因為通過免疫組織化學(xué)或細(xì)胞

10、化學(xué)染色判斷干細(xì)胞分化，需要先對細(xì)胞進(jìn)行固定處理，不能在活細(xì)胞狀態(tài)下觀察干細(xì)胞的心肌分化。本研究將心肌特異性肌球蛋白重鏈（alpha-myosin heavy chain, MHC）啟動子與增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）連接，構(gòu)建在心肌中特異表達(dá)的報告基因系統(tǒng)，使之用于在活細(xì)胞狀態(tài)下觀測判斷干細(xì)胞的心肌分化，為深入進(jìn)行干細(xì)胞的心肌分化研究奠定基礎(chǔ)。    1  材料與方法    1.1  材料限制性內(nèi)切酶SalI、Hind、NotI以及200

11、bp DNA ladder和Lambda DNA/Hind markers購自華美生物工程公司；Taq聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP和dATP購自Promega公司；pfu DNA聚合酶購自New England Biolabs公司；Lipofectamine 2000陽離子脂質(zhì)體購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；新生牛血清購自四季青生物材料有限公司；包含5.5 kb MHC啟動子的pNC26質(zhì)粒由Morehouse School of Medicine提供；包含EGFP cDNA的pLEGFP-C1質(zhì)粒購自Clontech公司；pGEM-T Easy Ve

12、ctor系統(tǒng)購自Promega公司；5端加有SalI和Hind酶切位點的EGFP cDNA PCR上下游引物（上游：5-GTC GAC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC -3，下游：5-AAG CTT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG -3）由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。    1.2  方法    1.2.1  pMHC-EGFP構(gòu)建策略（圖1）    1.2.2  EGFP cDNA擴增：以p

13、LEGFP-C1為模版，20 mmol/L的上下游引物各5 l，pfu DNA聚合酶1 l，10×buffer 5 l，10×dNTP 5 l，加雙蒸水至總反應(yīng)體積50 l。進(jìn)行聚合酶鏈（polymerase chain reaction, PCR）反應(yīng)：起始變性94 5 min，然后執(zhí)行94 30 s，60 30 s，72 90 s，30次循環(huán)，最后72 延伸10 min。低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收729 bp EGFP cDNA片斷。    1.2.3  “T”連接反應(yīng)：參照本所已建立的方法1-2，將回收純化的729 bp PCR產(chǎn)

14、物，加入10×buffer 5 l，10×MgCl2 5 l，2 mmol/L dATP 2 l，Taq酶2 l，加雙蒸水至總反應(yīng)體積50 l，72 孵育30 min?；厥占兓印癆”后的EGFP cDNA片斷（731 bp），加10×T4 DNA連接buffer 5 l，pGEM-T Easy vector 0.5 l，T4 DNA連接酶1 l，加雙蒸水至總反應(yīng)體積10 l，室溫連接3 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5，涂布含氨芐青霉素（100 g/ml）的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，藍(lán)白篩選，挑選白色單菌落接種于含氨芐青霉素（100 g/ml）的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12

15、 h，提取質(zhì)粒酶切鑒定。重組質(zhì)粒命名為pGEM-EGFP。                                 1.2.4  MHC-EGFP構(gòu)建：將pGEM-EGFP和pNC26分別用SalI/Hind雙酶切，前者回收729 bp片斷，后者回收線性化pNC26片斷。

16、兩種片斷充分混勻，在T4 DNA連接buffer 5 l，T4 DNA連接酶1 l，總體積10 l體系中室溫連接4 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5，涂布含氨芐青霉素（100 g/ml）的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h，挑選單菌落接種于含氨芐青霉素（100 g/ml）的TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒酶切鑒定。重組質(zhì)粒命名為pMHC-EGFP，經(jīng)NotI酶切，低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收7.2 kb的MHC-EGFP表達(dá)盒。    1.2.5  心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)：取1 d齡新生昆明小鼠10只，無菌條件下取出心臟，PBS漂洗，剪碎，加入0.125%胰酶+0.02% E

17、DTA消化液，37 水浴消化10 min，靜置后棄上清。繼續(xù)消化組織團(tuán)塊，每次加入消化液34 ml，37 水浴消化10 min，靜置后收集上清，2倍體積含15%新生牛血清DMEM中止消化，重復(fù)34次。直至組織團(tuán)塊基本消失。將收集的消化液2 000 rpm離心，棄上清，含15%新生牛血清DMEM重新懸浮細(xì)胞，以1×107/ml接種于25 cm一次性塑料培養(yǎng)瓶，于37 ，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)2 h，使大多數(shù)心肌成纖維細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)移尚未貼壁的心肌細(xì)胞至另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。    1.2.6  骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)：參考姚啟盛等3方法，取成

18、年昆明小鼠，無菌條件下分離雙下肢肌肉，PBS漂洗，剪碎，加入dispase 2.4 u/ml,collagenase 1%,CaCl22.5 mmol/l消化液37 水浴消化30 min，2倍體積含15%新生牛血清DMEM中止消化，以1×107/ml接種于25 cm一次性塑料培養(yǎng)瓶，于37 ，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。    1.2.7  MHC-EGFP表達(dá)盒轉(zhuǎn)染：上述心肌或骨骼肌成肌細(xì)胞接種2 d后，進(jìn)行MHC-EGFP基因轉(zhuǎn)染。將純化的5 g MHC-EGFP與等體積Lipofectamine 2000陽離子脂質(zhì)體50 l充分混勻

19、，靜置10 min后，細(xì)胞培養(yǎng)液中加入脂質(zhì)體DNA混合液，孵育6 h后換為普通完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，熒光顯微鏡（Nikon TE2000, Japan）觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)綠色熒光。    2  結(jié)果    2.1  EGFP cDNA擴增以pLEGFP-C1為模板，經(jīng)EGFP上下游引物PCR擴增后，2%瓊脂糖凝膠電泳可見特異性729 bp擴增片斷（圖2略）。    2.2  “T”連接反應(yīng)擴增產(chǎn)物EGFP cDNA通過Taq聚合酶加“A”，T4 DNA連接酶與pGEM-T eas

20、y vector連接，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)，挑選單菌落擴增，提取質(zhì)粒后，經(jīng)SalI和Hind雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳可見729 bp片斷（圖3略）。    2.3  pMHC-EGFP構(gòu)建pGEM-EGFP和pNC26經(jīng)SalI/Hind雙酶切，T4 DNA連接，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)，挑選單菌落擴增，提取質(zhì)粒后，經(jīng)SalI和Hind雙酶切，2%瓊脂糖凝膠電泳可見729 bp片斷（圖4略）。    2.4  心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)細(xì)胞接種后，經(jīng)差速貼壁去除大多數(shù)成纖維細(xì)胞，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)心肌特有多邊形或桿狀形態(tài)。接種10 h后觀察

21、到大部分細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動。    2.5  骨骼肌成肌細(xì)胞培養(yǎng)貼壁細(xì)胞呈扁平、多突起形態(tài)，胞漿極其豐富，生長迅速,符合成肌細(xì)胞特征。    2.6  MHC-EGFP表達(dá)盒轉(zhuǎn)染及鑒定心肌細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)MHC-EGFP表達(dá)盒轉(zhuǎn)染后48 h，部分細(xì)胞綠色熒光（圖5）。而基因轉(zhuǎn)染的骨骼肌成肌細(xì)胞始終未觀察到綠色熒光細(xì)胞。    3  討論心肌肌球蛋白（cardiac-myosin）是成年心肌特有的結(jié)構(gòu)蛋白，由2條重鏈（-MHC）和2條輕鏈（-MLC）組成。-MHC啟動子結(jié)構(gòu)于1

22、991年明確4。pNC26質(zhì)粒由pBlueScript SK+質(zhì)粒插入5.5 kb -MHC啟動子和0.6 kb人生長激素poly A構(gòu)建而成。緊鄰-MHC啟動子3含有SalI和Hind酶切位點。為了使EGFP cDNA定向克隆于-MHC啟動子3端的SalI和Hind位點，本研究采用兩端分別帶有SalI和Hind的EGFP cDNA擴增的上、下游引物，將PCR產(chǎn)物擴增后加入單個“dA”，利用TA互補原理，可以方便地將EGFP cDNA插入到pGEM-T easy vector，避免了PCR產(chǎn)物直接酶切不能被酶切位點識別的缺陷。本研究成功地將EGFP cDNA插入到pNC26質(zhì)粒的SalI和Hi

23、nd位點上，將pMHC-EGFP經(jīng)NotI酶切后釋放出了含-MHC啟動子、EGFP cDNA和poly A的EGFP表達(dá)盒。將該表達(dá)盒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而骨骼肌成肌細(xì)胞未見綠色熒光，說明MHC-EGFP表達(dá)盒在心肌細(xì)胞中特異性表達(dá)。MHC-EGFP心肌特異性表達(dá)盒對于監(jiān)測干細(xì)胞向心肌分化的研究具有重要意義。Takahashi等5證實，轉(zhuǎn)染MHC-EGFP表達(dá)盒的胚胎干細(xì)胞在心肌分化早期就可以觀察到綠色熒光，其敏感性和準(zhǔn)確性都明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色。因為MHC啟動子驅(qū)動的EGFP cDNA只有在心肌細(xì)胞中才能表達(dá)。這一特點可以方便地用來監(jiān)測各種因素誘導(dǎo)的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，尤其是可以在活細(xì)胞狀態(tài)下觀察，使進(jìn)一步對這些細(xì)胞進(jìn)行功能研究以及進(jìn)行分選純化成為可能。本研究為進(jìn)一步研究各種因素誘導(dǎo)的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化奠定了基礎(chǔ)。