抗中性粒細胞胞漿抗體ANCA的檢測及臨床意義

1、抗中性粒細胞胞漿抗體ANCA的檢測及臨床怠文稿歸稿存檔編號：KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA)檢測及臨床意義間接熒光免疫(HF)方法(歐盟)一、ANCA概念及分類抗中性粒細胞胞漿抗體是一種以中性粒細胞和單核細胞胞漿成份為靶抗原的自身 抗體，對系統(tǒng)性血管炎炎癥性腸病等多種疾病的診斷和鑒別診斷具有重要的意義，已成 為H身免疫性疾病的一項非常重要的常規(guī)檢測項目。目前:已經(jīng)有十余種中性粒細胞胞漿成分被證實為ANCA的靶抗原，蛋白酶 3(PR3),髓過氧化物酶(MPO),人白細胞彈性蛋白酶(HEL),乳鐵蛋白(LF),組織蛋白酶

2、 G(Cath G),殺菌/通透性增強蛋白(BPI),人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2),溶菌素 (LYS),天青殺素，防御素，烯醇化酶，葡萄糖醛酸酶。根據(jù)乙醇固定的中性粒細胞基質(zhì)片中，可以區(qū)分兩種不同的熒光模型：一種胞漿型(c-ANCA),是均勻分布在整個中性粒細胞胞漿中的顆粒型熒光，細 胞核無熒光。在乙醇和甲醛固定的中性粒細胞片中，其熒光模型表現(xiàn)相同。其主要的靶 抗原是蛋白酶3(PR3)。另一種是核周型(p-ANCA),是圍繞中性粒細胞細胞核周圍的平滑帶狀熒光。由 多種抗原引起，主要靶抗原是髓過氧化物酶(MPO),人白細胞彈性蛋白酶(HEL),乳鐵蛋 白(LF),組織蛋白酶G(Cat

3、h G),殺菌/通透性增強蛋白(BPI),人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2),溶菌素(LYS)等。不同抗體在乙醇和甲醛固定的中性粒細胞片中，其熒光模 型表現(xiàn)有所不同?？筂PO抗體產(chǎn)生的p-ANCA因耐甲醛，其熒光模型與在乙醇固定的中 性粒細胞中出現(xiàn)的c-ANCA類似故叫甲醛抗性的p-ANCAo而其他非MP0抗體不與甲醛固 定的中性粒細胞反應(yīng)，無熒光表現(xiàn)，這種類型又稱為甲醛敏感的p-ANCA。故根據(jù)乙醇 和甲醛固定的中性粒細胞片表現(xiàn)，可初步判定ANCA的靶抗原PR3, MP0,非MP0三類。二、ANCA的檢測間接熒光免疫方法是檢測ANCA的參考方法或者標(biāo)準(zhǔn)方法，至今也是最常用的經(jīng)典 方法。

4、IIF是區(qū)分c-ANCA和p-ANCA的基礎(chǔ)，有較高敏感性，可半定量，但IIF測定的 是總ANCA,不能準(zhǔn)確區(qū)分靶抗原，需特異性的檢測方法作為補充。由于多種免疫性疾病患者存在ANA,用IIF法檢測ANCA時，會產(chǎn)生干擾實驗結(jié)果的判斷。為避免干擾現(xiàn)象，采用了四基質(zhì)聯(lián)合的檢測即：乙醇固定的粒細胞；甲醛固定的粒細胞；Hep-2 （人喉癌細胞）細胞；猴肝細胞?；|(zhì)片各細胞分布及意義如表一所述。區(qū)分ANA的干擾：Hep-2細 胞有典型熒光表現(xiàn)，Hep- 2細 胞甲醛固定 粒細胞1：判斷 c-ANCA, 2：區(qū)分P-ANCA 對 甲醛敏感 還是耐受甲醛抗性p-ANCA：抗MPO 抗體耐甲醛，其熒光與在 乙

5、醇固定的中性粒細胞中 的c-ANCA類似甲醛敏感p-ANCA：其他非 MPO抗體不與甲醛固定的 中性粒細胞反應(yīng)，無熒光 表現(xiàn)區(qū)分ANA與ANCA：借助猴 肝細胞和其中的肝血竇粒 細胞。ANCA陽性，只有肝血竇粒猴肝 細胞乙醇固定 粒細胞是標(biāo)準(zhǔn)實驗基質(zhì)。區(qū)分兩種熒光模型：c-ANCA； p-ANCAoANCA熒光模型及表現(xiàn)如表二所述。表一：四聯(lián)基質(zhì)片分布及意義細胞出現(xiàn)熒光，。如果兩 者同時陽性，所有肝細胞 核都有熒光。表二：ANCA熒光模型及表現(xiàn)熒光模型熒光表現(xiàn)乙醇固定粒細胞甲醛固定粒細胞Hep-2 細 胞猴肝細胞A N A 陰 性c-ANCA陽性胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的 細顆粒熒光，胞 質(zhì)熒光清晰勾勒

6、出核的輪廓，分 頁核之間熒光增 強。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的 細顆粒熒光，胞 質(zhì)熒光清晰勾勒 出核的輪廓，分 頁核之間熒光增 強。陰性肝細胞本身無熒 光。僅肝血竇粒細胞 出現(xiàn)熒光。P"ANCA 陽性甲醛 耐受p-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平 滑絲狀帶熒光。熒光陽性的胞質(zhì) 主要集中在分頁 核周圍，形成環(huán) 狀或不規(guī)則的塊 狀。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的 細顆粒熒光，胞 質(zhì)熒光清晰勾勒 出核的輪廓，分 頁核之間熒光增 強。陰性肝臟細胞本身無 熒光。僅肝血竇粒細胞 出現(xiàn)熒光。甲醛 敏感P一 ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平 滑絲狀帶熒光。熒光陽性的胞質(zhì) 主要集中在分頁 核周圍，形成環(huán) 狀或不規(guī)則的塊 狀。陰性陰性肝臟細胞本身無

7、熒光。僅肝血竇粒細胞 出現(xiàn)熒光。A N A 陽 性ANCA陰性細胞核陽性，熒 光強度增強陰性細胞核呈 現(xiàn)熒光表 現(xiàn)，如 ANA所述肝細胞核陽性。肝血竇粒細胞未 見熒光。甲醛耐受P- ANCA陽性細胞核陽性，熒 光強度增強熒光表現(xiàn)如C- ANCA陽性，乙 醇，甲醛固定粒 細胞所述細胞核呈 現(xiàn)熒光表 現(xiàn)，如 ANA所 述。肝細胞和肝血竇 粒細胞都有熒 光。甲醛敏感P- ANCA陽性細胞核陽性，熒 光強度增強陰性細胞核呈 現(xiàn)熒光表 現(xiàn)，如 ANA所肝細胞和肝血竇 粒細胞都有熒 光。述。三、注意事項為提高對疾病診斷的特異性，檢測時應(yīng)注意以下問題1、檢測ANCA, 一般建議同時做IIF初篩和確認(rèn)實驗，以

8、提高ANCA的臨床應(yīng)用價值， 不做單獨初篩或單獨確認(rèn)實驗，以免降低對疾病診斷的特異性。2、不能僅檢測抗PR3和MPO兩種特異性抗體，而不檢測，這樣容易限制ANCA對疾病診 斷的特異性。3、用IIF檢測時，僅使用乙醇固定的粒細胞片，這樣不能嚴(yán)格排除ANA的干擾，容易 出現(xiàn)假陽性。四、臨床意義(一)ANCA與原發(fā)性小血管炎韋格納肉芽腫(WG),顯微多動脈炎(MPA),壞死性新月體性腎小球腎炎(NCGN)和變 應(yīng)性肉芽腫性血管炎(CSS)等等原發(fā)性系統(tǒng)性小血管炎的發(fā)病與ANCA密切相關(guān)，臨床上 己將上述疾病統(tǒng)稱為ANCA相關(guān)小血管炎。ANCA,特異性PR3抗體和抗MPO抗體的檢測已 成為原發(fā)性小血管

9、炎的敏感特異的血清學(xué)檢測項目。1、抗PR3抗體特異性PR3抗體為WG的標(biāo)志性抗體，抗PR3抗體熒光模型以c-ANCA為主。但以 c-ANCA診斷WG特異性為90%,而以抗PR3抗體的特異性可超過95%?？筆R3抗體在 其他的原發(fā)性血管炎中業(yè)可以檢測出來，但陽性率較低?？筆R3抗體敏感度與疾病的活動性及病程有關(guān)，在疾病的早期癥狀不明顯時，就可 出現(xiàn)陽性。因而抗PR3抗體常作為WG的早期診斷、療效判斷、復(fù)發(fā)估計的指標(biāo)，對臨床治療有重要的參考價值。2、抗MPO抗體抗MPO抗體熒光模型以p-ANCA為主，主要與MPA、NCGN> CSS相關(guān)。還可見于其他 疾病，如節(jié)結(jié)性多動脈炎，抗腎小球基底膜腎

10、病，WG, SLE, RA,藥物誘導(dǎo)的狼瘡， Felty綜合癥等?？贵w滴度與疾病活動性相關(guān)，可用于早期診斷、療效判斷、復(fù)發(fā)估計 的指標(biāo)，對臨床治療有重要的參考價值。抗MPO抗體陽性高度提示壞死性血管炎或特發(fā)性NCGN,對診斷原發(fā)性小血管炎的 特異性達到99%。因而每一個不明原因的血管炎或腎小球腎炎的患者，都應(yīng)該檢測 ANCAo表三：ANCA與原發(fā)性小血管炎相關(guān)疾病熒光模型靶抗原（）韋格納肉芽腫（WG）C , P （少見）PR3 (85) , MP0 (10)顯微多動脈炎（MPA）C , PPR3 (45) , MP0 (45)壞死性新月體性腎小球腎炎 （NCGN）C , P （少見）PR3 (

11、25) , MP0 (65)變應(yīng)性肉芽腫性血管炎（CSS）C , P （少見）PR3 (10) , NIPO (60)結(jié)節(jié)性多動脈炎（PAN）少見PR3 (5) , MP0 (15)抗腎小球基底膜病（抗GBN）PMPO（二）ANCA與藥物誘導(dǎo)性血管炎近年來不斷有藥物治療引起的ANCA陽性的病例報道，如丙基硫氧嗒咤，朋苯噠 嗪，普魯卡因酰胺，青酶胺，美滿霉素，他巴喋/甲毓咪喋等。其中報道比較多的是長 期使用丙基硫氧嗒咤引起的ANCA,其特點是滴度高，抗體譜廣（抗原主要是MP0,也可 同時伴有或單獨出現(xiàn)其他靶抗原，如PR3, LF, Cath G, BPI, LYS等）。藥物誘導(dǎo)性血管炎患者臨床表

12、現(xiàn)與原發(fā)性血管炎類似，停止丙基硫氧嗜喔用藥 后，臨床癥狀好轉(zhuǎn)，ANCA可轉(zhuǎn)陰。因此，長期使用丙基硫氧嗒咤治療過程中，應(yīng)定期 檢測ANCA,及早發(fā)現(xiàn)藥物誘導(dǎo)性血管炎。（三）ANCA與其他疾病除原發(fā)性血管炎外，其他一些疾病中也可出現(xiàn)ANCA,主要為p-ANCA,其靶抗原并 非 PR, MPO,而是 LF, Cath G, BPI, LYS 等1、慢性炎癥性腸病(CIBD)CIBD是一種消化系統(tǒng)的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC),克羅恩病 (CD)兩種。以往的CIBD診斷依賴X線檢查，內(nèi)窺鏡及組織學(xué)診斷，缺乏有效的試驗 室指標(biāo)。近年來研究發(fā)現(xiàn)UC病人血清中ANCA陽性率為60-80%,而CD患者的陽性率 為10-20%,多為p-ANCA,相關(guān)靶抗原有BPI等。滴度與疾病的活動度和病程無關(guān)。因 為p-ANCA在UC陽性率高，CD陽性率低，故可作為兩者的鑒別診斷及UC早期診斷指 標(biāo)。2、結(jié)締組織病在結(jié)締組織病中，ANCA陽性主要見于SLE和RA,其他結(jié)締組織病中少見。但文獻 報道在SLE和RA陽性率差異特別大(16-69%),這可能與使用方法，抗原基質(zhì)片及工 作人員水平有很大關(guān)系。SLE