原創(chuàng)Westernblot轉(zhuǎn)膜整個(gè)過(guò)程

1、此處填寫(xiě)公司名稱(chēng)文稿歸稿存檔編號(hào)：KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-轉(zhuǎn) 膜 (Trarsmembran)1轉(zhuǎn)膜的定義將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體(例如NC膜)上，通常 有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn) 和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場(chǎng)的 機(jī)械裝置不同。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白 轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。2轉(zhuǎn)移膜的選擇雜交膜的選擇是決定Westernblot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、 被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的 雜交膜。

2、用于Westernblot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC)和 PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液 的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的 結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫 下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著 膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45 Um 和0.2um兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45um的膜，小于 20kD的蛋白就要用0. 2 u m的膜了，如用0. 45 P m的膜就會(huì)發(fā)生"Blowthrough"

3、;的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的 膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用 純甲醇浸泡飽和5秒鐘。最常用于WesternBlot的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素(Nitrocellulose, NC )膜和聚偏二氟乙烯(PolyvinylideneFluoride, PVDF)膜,此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素 膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交。硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合,無(wú) 需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響??；非特異性本底顯色淺；價(jià)格低 廉，使用方便。但結(jié)合在NC上的小分子蛋

4、白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失；NC韌性 較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride, PVDF)膜：與蛋白質(zhì)親和力高， 用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷 蛋白結(jié)合。膜的選擇主要根據(jù)：P膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力(也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載 量)，以及膜的孔徑(也就是攔截蛋白的大小)；P不影響后續(xù)的顯色檢測(cè)(也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好)；P如果后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測(cè)序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù) 不同目的來(lái)挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。幾種膜的性質(zhì)對(duì)比PVDF膜NC膜 尼龍膜背景低低較高蛋白結(jié)合能力 100-200 u g/cm2 5

5、八 / n >400ug/cm2 100 P g/cm2機(jī)械強(qiáng)度強(qiáng)干的膜很脆軟而結(jié)實(shí)溶劑抗性強(qiáng)差差使用前處理甲醛潤(rùn)濕緩沖液潤(rùn)濕緩沖液潤(rùn)濕價(jià)格高較低低3轉(zhuǎn)膜步驟（以槽式濕轉(zhuǎn)為例）1 .將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡lOmin。注意：如檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。2 .依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡lOmin。如用 PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。（先把PVDF膜在甲醇中浸泡約 15s,小于Imin,然后把膜放在IX轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡，然后上面鋪2層濾 紙浸泡）3 .裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后， 用試管趕去

6、氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。4 .將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（夾的黑面對(duì)槽的黑面，夾的白面 對(duì)槽的紅面），（因?yàn)殡娹D(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來(lái)降 溫），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V, lh （電流350mA, lh30min） o 注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5 .轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。4轉(zhuǎn)膜注意事項(xiàng)1 .泡膜：轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min； a.凝膠若是沒(méi)在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會(huì)在轉(zhuǎn)膜過(guò)程中出現(xiàn)凝膠 皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。b.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。2 .轉(zhuǎn)膜順序：陰

7、極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽(yáng)極碳板；3 .轉(zhuǎn)膜條件：0.35A/250V/lh/40min/冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)膜過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，注意冷卻）；（具體轉(zhuǎn)膜時(shí)間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時(shí)間越長(zhǎng)，反之則短。）4 .其它注意事項(xiàng)：a.避免直接用手碰雜交膜，使用鑲子。因?yàn)槭稚系牡鞍缀陀椭瑫?huì)影響轉(zhuǎn) 膜效率并會(huì)使膜臟掉。b.夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒(méi)有氣泡存在，否則會(huì)導(dǎo) 致轉(zhuǎn)膜不完全。c.保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過(guò)大和過(guò)小都會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效率。d.雞來(lái)源的抗體與PVDF和尼龍膜有較強(qiáng)的結(jié)合能力，從而產(chǎn)生較高的背 景，故如果選擇雞來(lái)源的抗體最好使用硝酸纖維素膜（NC膜）。5轉(zhuǎn)膜后檢測(cè)（此步可以省略）轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的TBST （或PBST）中漂洗 1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀(guān)察所使用的預(yù)染蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效 果也可以用麗春紅染色液或硬度墨汁染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀(guān)察實(shí)際 的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠 進(jìn)行染色，以觀(guān)察蛋白的殘留情況。a.麗春紅染色：蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾 膜，換水兒次。b.印度墨汁染色：只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的