BDFACSCalibur流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀操作與維護程序目 的：規(guī)范BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀操作與維護程序，正確使用設(shè)備，保證實驗順利進(jìn)行、操作人員人 身安全和設(shè)備安全。適用范圍：本規(guī)程適用于BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀的使用操作。責(zé)任者：操作人員：負(fù)責(zé)按照本規(guī)程操作儀器設(shè)備，對儀器進(jìn)行日常維護，并作使用記錄。保管人員：負(fù)責(zé)監(jiān)管儀器操作是否符合規(guī)程，并對儀器進(jìn)行定期維護、保養(yǎng)?？剖邑?fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)對儀器設(shè)備的綜合管理。內(nèi) 容：1 .每日開機程序1.1 在氣壓閥減壓的狀態(tài)下檢查鞘液桶，確認(rèn)：1.1.1 鞘液充滿狀態(tài)，約 3L1.1.2 蓋緊蓋子1.1.3 安上金屬擋板1.1.4 管

2、路暢通，無扭曲1.2 .檢查廢液桶，確認(rèn)：1.2.1 廢液桶充滿400ml漂白劑1.2.2 管路暢通，無扭曲1.3 打開流式細(xì)胞儀。1.4 打開電腦。1.5 氣壓閥置于加壓位置，并排除管路中氣泡。1.6 做 Prime。1.7 等待機器預(yù)熱510分鐘后可開始試驗。2 .每日關(guān)機程序2.1 用3mlFACSClean洗液加入樣品管中上樣，將樣品支撐架置于旁位，以外套管吸入1ml。2.2 將樣品支撐架置于中位，以 HI RUN運行10分鐘，使內(nèi)管吸入 約1ml。2.3 將樣品管換成蒸儲水重復(fù)1-2步。2.4 放置盛有1ml蒸儲水的試管于樣品支撐架上。2.5 選才i Standby模式10分鐘，將激

3、光冷卻后可關(guān)掉主機。2.6 退出所有應(yīng)用軟件，關(guān)閉電腦。2.7 將流式細(xì)胞儀的壓力閥置于減壓狀態(tài)。3 .每月維護程序3.1 將FACSClean洗?12L裝入鞘液桶。3.2 旁路鞘液過濾器（過濾器上的快速接口從SANLINEFILTER端斷開，將鞘液白色管路液路取下聯(lián) 至ij SANLINE FILTER端口）,以防傷害。3.3 將盛有 3ml FACSClean 洗液的試管置于樣品支架上，以HI RUN 30 分鐘。3.4 將鞘液和樣品換成蒸餾水重復(fù)步驟3，以 HI RUN 60 分鐘。3.5 將鞘液桶裝滿鞘液，恢復(fù)過濾器。3.6 以 HI RUN 10-20 分鐘。3.7 在測定正式樣品之

4、前實施每日開機程序。4 . FACScomp 自動質(zhì)控操作4.1 試劑準(zhǔn)備4.1.1 三色試劑的校正（Cat No： 340486）4.1.1.1 取四色試劑盒中的Unlabeled 試劑，充分混勻，加一滴到裝有1ml 鞘液的試管中，混勻，標(biāo)記為 unlabeled 。4.1.1.2 取 FITC、 PE、 PerCP、 unlabeled 試劑，充分混勻，各加一滴到第二支裝有2ml 的鞘液的試管中，混勻，標(biāo)記為mixed。4.1.1.3 上機進(jìn)行儀器的校準(zhǔn)。4.1.2 或四色試劑的校正（Cat No： 340486； Cat No:340487 ）4.1.2.1 取試劑盒中的unlabele

5、d試齊U和APC試齊U各一滴力口入至U第一支裝有1ml鞘液的試管中，混勻。4.1.2.2 取 5 種試劑（FITC、 PE、 PerCP、 APC、 Unlabeled ）各一滴加入第二支裝有2ml 鞘液的試管中，混勻。4.1.2.3 上級進(jìn)行儀器的校準(zhǔn)。4.2 Calibrite beads FACScomp 上機操作的具體步驟4.2.1 執(zhí)行 FACSalibur 開機程序；4.2.2 執(zhí)行 FACScom歆件；4.2.3 在運行“ Sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，計算機將保存這些信息；單機“Acceppt ”；4.2.4 進(jìn)入"Set Up窗口

6、，先看最左側(cè)的 Assay selection 選項，在里面選中 Lyse/Wash或Lyse/No Wash；4.2.5 在 Calibrite Beads Lot IDS 中，根據(jù)每種顏色的beads 所對應(yīng)的Lot ids ，輸入編號，次編號在 Calibrite Beads 試劑盒內(nèi)，打開新買的試劑盒，里面有一張橙色膠紙，取出貼在試劑盒的背面，標(biāo)題是 Calibrite BeadsTM3Batch NO,選擇 FACS Flow Sheath 下的編號（右側(cè)的編號）；如做四色校正，同樣方法輸入Calibrite BeadsTM APC的IDS。4.2.6 在右側(cè)的保存選項中文件會自動保

7、存，路徑 FacstationBD fileFACSCompDDMMYY,還可以單 擊“ Location ”改變保存路徑；4.2.7 其他的不要改動，直接單擊“ run”出現(xiàn)PMT1窗，然后準(zhǔn)備好上樣管；4.2.8 上第一管后單擊 start ,儀器開始自動調(diào)節(jié)PMT完成后儀器會在窗口底部出現(xiàn)一行提示：“ PMTs set Successfully ”，這時軟件會暫停 5 秒，然后自動進(jìn)入下一個調(diào)節(jié)窗口（Comp 窗口 ） ；如果是四色微球調(diào)試，儀器還會對激光的延遲進(jìn)行測試，直到儀器電腦屏幕出現(xiàn)提示: “ Time DelayCalibration was successful ,然后才會同

8、樣自動進(jìn)入下一個調(diào)節(jié)窗口（Comp0 口）；4.2.9 上第二管，單擊start ，儀器開始自動調(diào)節(jié)補償并進(jìn)行靈敏度測試。完成后儀器會給出提示，最后軟件給出一個 Summary Report。檢查報告中的“ Result ”是否都 PASS如果有沒有 PASS堅持原因。 （ 1 ）是否試劑過期（2）兩個試管中的液體和鞘液桶中的是否相同（3）鞘液是否合格（4）日常維護是否充分適當(dāng)（5）聯(lián)系BD人員4.2.10 打印報告，退出 FACScom獻(xiàn)件；4.2.11 計算機會自動把 FACScompB式結(jié)果保存在 Calib File或Calib File .LNW （免洗試驗）中，運行其他程序，調(diào)用這

9、些結(jié)果就可以進(jìn)行樣本的檢測。注意事項：1 、第一管的速率不能低于400 個 / 秒（ run high ） ，少于時可以補一滴Unlabeled 。2 、兩個試管中的鞘液必須和鞘液桶中的是同一種液體。5 .FACScomp校正HLA-B27的操作說明5.1 試劑的準(zhǔn)備：取 HLA-B27 試劑盒的 HLA-B27 calibration beads （Cat No : 340183）試劑，混勻，加兩滴到裝有 1ml 鞘液的試管中，混勻，待測。5.2 FACScomp 上機檢測HLA-B27 的具體步驟5.2.1 執(zhí)行FACSCalibur 開機程序；5.2.2 運行 FACScom歆件；5.2

10、.3 在出現(xiàn)“Sign in ”窗口中輸入操作者姓名、單位、領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，計算機將保存這些信息；單機“Accept”；5.2.4 進(jìn)入“ Set up ”窗口，先看最左側(cè)的 Assay selection 選項，選擇HLA-B27 Assay ，在進(jìn)行HLA-B27 Assay 之前，必須一次性的通過Lyse/Wash Assay 校正；5.2.5 在右側(cè)框中輸入正確的HLA-B27 Lot No 值、 Suffix 值和 Beads Lot No 值。這些參數(shù)分別決定了 FL1 PMT的標(biāo)準(zhǔn)和decision maker的位置。對于結(jié)果至關(guān)重要，不可弄錯；5.2.6 在右側(cè)的保存選項中

11、文件會自動保存，路徑日期，還可以單擊“Location ”改變文件保存路徑；其他的不需要改動，直接單擊“ run”出現(xiàn)PMTW窗，然后準(zhǔn)備好上樣；5.2.7 放上 Beads 管后單擊start ， 儀器開始自動調(diào)節(jié)PMT。 完成后儀器會在底部出現(xiàn)一行提示：“ PMTsset successfully ”這時軟件會暫停 5 秒，調(diào)試后的結(jié)果會自動保存在Calib File.B27 中，并生成summary Report ；5.2.8 退出FACScom歆件，然后進(jìn)入 HLA-B27軟件進(jìn)行檢測。6 .MultiSET 四色免洗淋巴細(xì)胞亞群的絕對計數(shù)6.1 實驗原理：用已知總數(shù)的熒光微球Bead

12、s 做標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，加入血中，再加入熒光抗體，應(yīng)用流式細(xì)胞儀中的獲取和分析軟件，就可以得出血中CD3 CD4 CD& B、NK細(xì)胞的絕對數(shù)。細(xì)胞（/ul ）=（細(xì)胞獲取數(shù)x Beads總量）/ （Beads獲取數(shù)樣本量）6.2 主要試劑：6.2.1 抗體：CD3/CD8/CD45/CD4 CD3/CD16+56/CD45/CD19四色熒光抗體。6.2.2 Trucount 管（內(nèi)含數(shù)量已知的Beads） 。6.2.3 FACS Lysing Solution （溶血素）（10X ,使用前用蒸儲水稀釋成1X）6.3 實驗步驟:6.3.1 取2支TruCount管，順序編號 A和B;6.3.2

13、 用反向加樣法在Tube 中加入 50ul 充分混勻的抗凝全血; 注意 : 血不要碰到試管底部的微球（Beads） 。6.3.3 取 20U1CD3/CD8/CD45/CD4 抗體力口入至U A管中；取 20U1CD3/CD16+56/CD45/CD19 抗體加入到 B管中。注意：不要碰到血。渦旋混勻，室溫避光放置15-20min ；6.3.4 加入450ul 1 XFAC的血素，充分混勻，室溫避光放置15min；6.3.5 24 小時內(nèi)上機，用MultiSET 軟件獲取15000 個細(xì)胞進(jìn)行檢測，上機前應(yīng)充分混勻。6.4 注意事項：6.4.1 樣本使用EDTA抗凝全血，室溫放置，24小時內(nèi)處

14、理，處理前充分混勻。6.4.2 取血時要采用反向加樣法，即加樣槍吸取血樣時，打到第二擋，放時打到第一檔，保證血量 的準(zhǔn)確，減少誤差。6.4.3 染色和溶血步驟應(yīng)在室溫避光進(jìn)行，并充分混勻，過程中盡量防止血樣的飛濺，以免血樣留 在管壁上。6.4.4 本實驗為免洗試劑，操作簡單，減少細(xì)胞的丟失提高工作效率和計數(shù)精確度。6.4.5 TruCOUNT管2-25C保存，從冰箱取出后，應(yīng)恢復(fù)室溫再打開封條，保證TruCOUNTf包裝袋密閉，袋內(nèi)干燥劑變成粉紅色時，TruCOUNTt應(yīng)棄去不要7 MultiSET 軟件收獲分析的具體操作7.1 執(zhí)行 FACSCalibur 開機程序，進(jìn)入MuliTSET 軟

15、件。7.2 在出現(xiàn) “ sign in ” 窗口中輸入操作者姓名、單位、 負(fù)責(zé)人姓名等信息，計算機將保存這些信息；相關(guān)信息，單機“Accept ”。7.3 進(jìn)入“ set up ”窗口：7.3.1 在“ Data Source ”對話框中選擇“From Cytometer ： Acquisition and Analysis ”；7.3.2 在“ Automatic Saving Options ”中選者“Data File ”、 “ laboratory Report ”、 “ PhysicianReport ”， 軟甲會自動生成并保存報告文件，文件的默認(rèn)路徑FaacstationBD fi

16、leMultisetDDYYMM文件夾；7.4 在“ View Report ”中選擇“Until Next Button Pressed ” .7.5 然后單擊“ Accept”，進(jìn)入“ FACSComp窗口，單擊“ skip FACSComp （四色儀器調(diào)整 FACSComp 在檢測前單獨完成，見FACSCom操作部分）。7.6 進(jìn)入“ Test Prefs ”窗口，在“Physicians Report Choices ”一項可以全選，運行一種試劑，會自動報告相應(yīng)的結(jié)果。在“Lot ID ”中輸入 TruCount 管批號和Beads 總數(shù)（標(biāo)在包裝袋上），單擊“Accept ” 。7.

17、7 進(jìn)入“Samples”窗口，在表格中輸入相應(yīng)的Patient Name、IDCase Number和在Panel中選擇 4color TBNK+Truc ；7.8 在窗口最上方“Cytometer ”的下拉菜單中依次選擇“Detectors/Amps ” 、 “ Threshold ” 、“ Compensation ”、“ Staus ”， 出現(xiàn)相應(yīng)的四個窗口；在 “ Cytometer ” 的下拉菜單中，單擊 “ InstrumentSetting ” ，在出現(xiàn)的新對話框中單擊“open ” ；打開路徑下FacstationBD fileInstrumentSettingCalibur

18、.LNW 文件，調(diào)用儀器各個參數(shù)條件，最后單擊“Open” “ Set ”“ Done”。7.9 單擊“ Run Test "，上樣，此時調(diào)整 SSC電壓和閾值，單擊“ Acquire7.10 獲取完成后，可以打開屏幕底部的“ Manual Gate” 人工調(diào)整各個門的大小，單擊 “ Continue ”，進(jìn)入醫(yī)生報告窗口“Phys Report ”，可打印。7.11 繼續(xù)其他實驗，或單擊“Quit ” , “ Don t Save ” , 退出 MultiTest 軟件。操作中特別注意第3-7 步，尤其是第7 步。注意： 做相對計數(shù)時，用普通的流式管代替TruCount 管，在 P

19、anel 中選擇 4colorTBNK 。做三色絕對或相對計數(shù)時，只需改變Panel 即可。8 CellQuest Pro 雙色淋巴細(xì)胞亞群分析樣本制備8.1 實驗?zāi)康模菏褂秒p色組合標(biāo)記抗體對人外周血中淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測，了解認(rèn)得免疫狀態(tài)。從而指導(dǎo)臨床診斷和治療。8.2 實驗原理：利用熒光技術(shù)，在不同的鼠抗人的抗體上標(biāo)記熒光素，此熒光抗體就同人淋巴細(xì)胞表面是CD分子特異性的結(jié)合；然后用流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)合分析軟件的自動分析，便可以得出各亞群細(xì)胞的百分比。8.3 主要試劑：8.3.1 流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）,臺式離心機，渦旋振蕩器，微量移液器（1000 L、200科L、20L,流

20、失細(xì)胞專業(yè)試管、鞘液； PBS （力口 0.1%疊氮鈉）；8.3.2 雙色檢測試劑： Isotype Control （ MouseIgGi/IgG 2a）CD3-FITC/CD19-PE CD3-FITC/CD4-PE CD3FITC/CD8-PE CD3-FITC/CD16+CD56-PE8.3.3 FACS Lysing Solution紅細(xì)胞裂解液（10 x ,使用前用蒸儲水稀釋成1 X ）。8.3.4 1% 的多聚甲醛，配制方法:稱1.0克多聚甲醛加少量 PBS放入56c水浴箱中使之溶解，用 1N NaOHm和1N的HCL調(diào)整PH值 在6.9-7.0，然后加入100ml容量瓶中定容，

21、最后用0.45 m的濾膜過濾。8.4 實驗步驟：8.4.1 取5支流式試管，編號為 1、2、3、4、5,分別取10 dL抗凝全血加入每支試管中，注意不要碰到管壁。8.4.2 輕輕混勻，依次力口入20 dL 雙標(biāo) Isotype Control（ MouseIgG1/IgG 2a）、CD3/CD19 CD3/CD4CD3/CD8 CD3/CD16+CD5凌光抗體。室溫避光保存20分鐘。8.4.3 取出試管，每管加入10倍稀釋的1XFACS Lysing Solution 2ml ,渦旋混勻，避光 10分鐘。300g離心5min ,棄去上清液。8.4.4 每管加入2ml 的 PBS， 渦旋混勻，3

22、00g 離心 5min， 棄去上清液。然后加入0.5mlPBS 混勻，4避光 1h 內(nèi)上機檢測；若不能及時上機，加入0.5ml 1% 多聚甲醛，放4冰箱保存，48h 內(nèi)上檢測。9 .CELLQuest Pro 的簡要操作步驟（1）Acquisition 獲取數(shù)據(jù)9.1 打開獲取模板（ACQt件），如無現(xiàn)成的模板則制作新模板：9.1.1 選擇點圖或直方圖工具，在窗口拖出大小合適的方框，點擊圖形的邊緣9.1.2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口選擇：9.1.2.1 Plot Type 點圖類型：如Acquisition 獲取9.1.2.2 X Parame

23、ter 橫軸參數(shù)：如FSC;Y Parameter 縱軸參數(shù)：如SSC9.1.2.3 Gate 設(shè)門：如No Gate 或 G1=R19.1.3 圖形設(shè)置完畢，選擇SAVE AS,保存為ACQ文件9.2 聯(lián)機 Acquire fConnect to cytometer ，出現(xiàn) Acquisition control 和 Browser 窗口，先斗B Browser窗口最小化；9.3 數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：9.3.1 Acquire fAcquisition& Storage-設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（10000-ALL） -OK9.3.2 打開最小化的-Browser 對話框選擇：-Director

24、y :單機Change設(shè)定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File 設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴 （ Prefix ） -自定義； 文件后綴 （ Suefix ） -管號 （設(shè)為 1） ，單機 ok；- 檢測或設(shè)置panel ，確定試驗組合；如果沒有相應(yīng)的 panel則設(shè)置新的panel : Acquire fEdit panel ,在彈出的對話框單擊add選項，在 new panel 中輸入新的panel 名稱，然后單擊前面的三角選中該panel 激活 Tubes 窗口，單擊add加試驗管，編輯各試驗管的P1, P2, P3, P4確定實驗組合，單擊 ok;然后按照已有 panel操作；已有 pan

25、el 的在 Untitled Acquire Tube List下來菜單中選擇 Load Tubes From Panel f選擇新編輯或?qū)嶒瀸?yīng)的panel9.3.3 Acquire fCounter 打開計算器。9.4 打開獲取條件窗口，調(diào)出實驗獲取條件（Instrument Setting ）9.4.1 Cytometer-Detectors/Voltage ， Threshold ， Compensation9.4.2 Cytometer-Instrument Setting-Open 打開實驗獲取條件（FACSStation-BD File- InstrumentSetting Fi

26、les-Calib file 或者 Calib file.LNW ） Open-set-done9.4.3 實驗獲取條件的調(diào)整：Acquisition Control-"Setup-上樣（第一管）-Acquire-進(jìn)行實驗獲取條件的調(diào)整：FSC SSC電壓。FSC閾值（Threshold ）：減少碎片。設(shè)門：FSC/SSC點圖設(shè)門（R1）;熒光（FL）點圖（如FL1/FL2）或直方圖（如 FL1）取門G1=R1（點 擊圖形的邊緣-Inspector-Gate ： G1=R1）。陰性對照管，調(diào)整熒光電壓（ FL1、FL2、FL3、FL4Voltage ）,使陰性群體在左下角，確定十字位

27、 置。換地 2 管，多色實驗的補償管（單陽性），調(diào)整熒光間補償（Compensation ） ：（ 1 ） Cytometer-Instrument Setting-Save 保存實驗獲取條件（InstrSet+ 實驗獲取名稱）-Done （此步驟為可選項）；File-Save保存卞II板ACQt件（新作模板）。（ 2） Acquisition-Counter ，打開計數(shù)器。9.5 順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control- Setup- 上樣 -Acquire- 儀器獲取足夠細(xì)胞后，自動保存數(shù)據(jù)文件（data file ） ， Quit- Don t save10.CE

28、LLQuest Pro 的簡要操作步驟（2）10.1 Analysis 數(shù)據(jù)分析（新作模板ANA文件）10.1.1 做FSC/SSC點圖，圈細(xì)胞 R110.1.1.1 選擇點圖工具，在窗口拖出大小合適的方框，點擊圖形邊緣10.1.1.2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口選擇：Analysis 分析； Select File 選擇第一管數(shù)據(jù)文件；X Parameter 橫軸參數(shù)-FSC;Y Parameter 縱軸參數(shù)-SSC； Gate 設(shè)門 -No Gate10.1.1.3 選擇設(shè)門工具-在FSC-SSC嵐圖上，圈細(xì)胞 R1 10.1.2 做陰性對照

29、管門內(nèi)細(xì)胞的FL1/FL2 點圖，設(shè)十字，區(qū)分陰性和陽性界限1.1.1.1 1 選擇點圖，在窗口拖出大小合適的方框，點擊圖形邊緣1.1.1.2 2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口選擇：Analysis 分析； Select File 選擇陰性對照管數(shù)據(jù)文件；X Parameter 橫軸參數(shù)-FL1;Y Parameter 縱軸參數(shù)-FL2 ； Gate 設(shè)門 -G1=R11.1.1.3 3 選擇十字工具-在陰性對照管FL1/FL2 點圖上，沿陰性群體設(shè)十字10.1.3 做各實驗管門內(nèi)細(xì)胞的FL1/FL2 點圖，拷貝陰性對照管的十字10.1.3.1 選

30、擇點圖，在窗口拖出大小合適的方框，點擊圖形邊緣10.1.3.2 Windows-show Inspector ， Inspector 窗口選擇：Analysis 分析； Select File 選擇實驗管數(shù)據(jù)文件；X Parameter 橫軸參數(shù)-FL1;Y Parameter 縱軸參數(shù)-FL2 ； Gate 設(shè)門 -G1=R110.1.3.3 店中陰性對照管FL1/FL2 點圖上的十字=Edit-Copy- 點中試驗管FL1/FL2 點圖 -Edit-Paste10.1.4 做各實驗管FL1/FL2 點圖的十字統(tǒng)計：點中試實驗管FL1/FL2 點圖 -Stat-Quadrant Stat-

31、出現(xiàn)統(tǒng)計結(jié)果- 點中統(tǒng)計結(jié)果框-Stat-Edit Quadrant Stat- 選擇輸出結(jié)果（如Percent of gated 門內(nèi)細(xì)胞陽性百分率）。10.1.5 選擇文字工具（A） ，在報告上添加文字說明，報告實驗結(jié)果。10.1.6 Save As 保存分析模板（ANA文件）或分析結(jié)果，Print打印分析結(jié)果。10.2 Analysis數(shù)據(jù)分析（已有模板ANA文件）打 開 已 保 存 的 分 析 模 板 （ ANA 文 件 ） ， 依 次 改 變 各 圖 要 分 析 的 數(shù) 據(jù) 文 件 （ Edit-Select All-Plots-Change Data File ） ， 在出現(xiàn)的窗口

32、中按文件存儲路徑找到數(shù)據(jù)，選中第一關(guān)文件-open ；在空白處單擊一下鼠標(biāo)，選中第三個圖標(biāo)按蘋果+ 調(diào)出第二管文件；第四個圖蘋果 + 以此類推，調(diào)整圈細(xì)胞群的門R1 的位置，調(diào)整十字門位置，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果更改報告中結(jié)果，打印分析結(jié)果。11 .HLA-B27 分析和軟件操作11.1 樣本的制備：11.1.1 試劑：11.1.1.1 HLA-B27 試齊J盒-包括抗體試劑 A,10X溶血素試劑 B,微球試劑 C11.1.1.2 抗凝全血11.1.1.3 流式細(xì)胞實驗常規(guī)試劑和儀器。11.1.2 制備流程：11.1.2.1 在試管上對應(yīng)于每一個樣本做好識別標(biāo)志（每個樣本一個試管）11.1.2.2 加3

33、0 dL抗體到試管中11.1.2.3 用微量移液器小心滴將50以充分混勻的康寧血加到進(jìn)樣管的底部，確保WBC勺濃度在3.5X 103-9.4 X 103WBC/cL之間，低速混勻 3秒鐘，室溫避光靜置15-20分鐘；注意：小心避免血樣加到試管壁上，一面血與試劑不能充分接觸，靜置時避免樣本直接光照。11.1.2.4 將10X溶血素用蒸儲水稀釋成1X,每管中加入 2ml試問的1X溶血素，立即低速混勻，避光試問靜置10 分鐘，不要超過12 分鐘；注意：溶血時間不應(yīng)太長，以免破壞白細(xì)胞。11.1.2.5 隨后室溫300g 離心 5min11.1.2.6 棄去上清液，留大約 50 dL液體于試管中以免損

34、傷細(xì)胞團11.1.2.7 低速混勻，重懸細(xì)胞，每管中加入2ml含0.1%疊氮鈉的PBS清洗細(xì)胞，低速混勻，室溫300g 離心 5min11.1.2.8 吸去上清液，留大約 50 dL液體于試管中以免損傷細(xì)胞團11.1.2.9 低速混勻，重懸細(xì)胞，每管中加入含1%-2%|；聚甲醛的PBS來固定細(xì)胞，低速混勻，固定30 分鐘11.1.2.10 將已處理好的樣本管蓋好，避光保存于2- 8以待上機檢測。最好在染色后24小時以內(nèi)分析樣本，上樣前充分混勻懸液以防細(xì)胞聚集。11.2 HLA-B27 自動軟件上機檢測的具體步驟11.2.1 執(zhí)行FACSCalibur開機程序，進(jìn)入 HLA-B27軟件。11.2

35、.2 在出現(xiàn)的“ sign in ” 窗口中輸入操作者姓名、單位、 領(lǐng)導(dǎo)姓名等相關(guān)信息，單擊 “ Accept ”，計算機將保存這些信息。11.2.3 進(jìn)入 “ set up” 窗口，首先在 “ Data Source ” 對話框中選擇“ From Cytometer ”， 并輸入 “ 15000”。然后在：A）“ File name perfix ”中選擇“Patient name ”；B）在“Automatic Saving Options "中選擇好"Data File "、"Laboratory Report ”,軟件會自動生成一個文件夾，文件的

36、默認(rèn)路徑Facstation G5BD filesHLA-B27DDMMYY 文件夾；C）單擊“ Location ”可改變文件保存路徑；在出現(xiàn)的新的對話框中指定的文件夾，選好文件夾后，單擊對話框底部的“ chose”（此步驟為可選項）。D）在“View Report "中選擇"Until 'Next' Button Pressed 最后單擊“Accept”。11.2.4 進(jìn)入“ FACSComp窗口，在這里可以進(jìn)入FACSCom欹件，做 HLA-B27 beads的調(diào)試。如果之前做了就單擊“Skip FACSComp”。11.2.5 進(jìn)入“ Patient

37、s ”窗口，在表格中輸入相應(yīng)的 Patient Name 、 ID、 Case Number。11.2.6 然后單擊“ Run ,單擊“ Acquire不要調(diào)節(jié)儀器的設(shè)置，儀器會自動調(diào)出條件。獲取完成后打印 Laboratory Report 。11.2.7 如果要繼續(xù)檢測單擊“More Tests ”，如果退出單擊“QUIT” -“ Don t save ”。11.2.8 退出軟件，按每日關(guān)機程序清洗儀器，關(guān)機。11.3 或用Cellquest Pro/Cellquest手動軟件進(jìn)行 HLA-B27獲取和分析11.3.1 打開獲取模板（HLA-B27 ACQ文彳）；或制作新模板：11.3.1

38、.1 選擇點圖或直方圖工具，總共畫三個圖，兩個散點圖，一個直方圖。11.3.1.2 散點圖 FSC/SSC 畫出一個新的散點圖后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇： Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC； Y Parameter 縱軸參數(shù)：SSC；選擇 Multicolor gate 屬性， Gate 設(shè)門：如No Gate ；11.3.1.3 散點圖 FSC/CD3PE,畫出一個新的散點圖后，在 Windows-show Inspector , Inspector 窗口選擇：Acquisi

39、tion-Analysis 分析； X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC； Y Parameter 縱軸參數(shù)：CD3PE;在圖中畫門 R1圈上CD3書日性的細(xì)胞；11.3.1.4 直方圖 HLA-B27 FITC/Counts ，畫出一個新的直方圖后，在Windows-show Inspector ，Inspector 窗口選擇：Acquisition-Analysis 分析； X Parameter 橫軸參數(shù)：FITC, 選擇門 G1=R1選才I Maker工具，在直方圖中畫M1,圈定所有細(xì)胞，選中這個直方圖，對直方圖進(jìn)行統(tǒng)計-His-Stats ,統(tǒng)計框中選擇 File Name、Ma

40、ker label 、Gate> Mean和 Median;并且改 Plot 菜單下的 Log dataUnit 屬性為 Chanel ， Acquire 菜單下 Acquisition Storage 中的 Resolution 屬性為256。11.3.1.5 設(shè)計試劑參數(shù)，在 Acquire 菜單中選擇Paarameter Description ， 在對話框中設(shè)定：P1=FSC，P2=SSC， PS=HLA-B27 FITC， P4=CD3 PE。11.3.1.6 圖形設(shè)置完畢，選擇 SAVE AS保存為HLA-B27 ACQ文件模板。Acquisition Control 窗口；

41、11.3.2 聯(lián)機 Acquire-Connect to cytometer11.3.3 數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：11.3.3.1 Acquire-Accquisition Storage- 設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（10000-ALL ） -OK11.3.3.2 Windows-Browser 對話框選擇：-Directory 設(shè)定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File 設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴（Prefix ） -自定義；文件后綴（Surfix ） -管號；11.3.4 打開獲取條件窗口，調(diào)出實驗獲取條件（Instrument Setting ） ；11.3.4.1 Cytometer-Detectors/

42、Voltage11.3.4.2 Cytometer-Instrument Setting-open下找到并選擇Calibur file.B27Threshold 。，在 Facstation G5BD fileInstrument 文件， Open-Set-Down.11.3.5 樣本優(yōu)化實驗條件：Acquisition（不能調(diào)節(jié)各熒光電壓和補償）：Control ? Setup- 上樣 -Acquire- 進(jìn)行實驗獲取條件的調(diào)整-調(diào)整FSG SSC電壓使細(xì)胞完全顯示在 FSC/SSC圖上;- 調(diào)整FSC閾值（Threshold ）：減少碎片;-調(diào)整FSC/CD3 PE中的R1,圈定需要分析的

43、細(xì)胞（CD3+）;-調(diào)整HLA-B27/Counts中的M1,圈定所有細(xì)胞。（M1可以畫的大一些）- 可以保存經(jīng)樣本優(yōu)化過的實驗條件：Cytometer-Instrument Setting-Save 保存實驗獲取條件 （ InstrSet B27 ） -Done。11.3.6 順序上樣，獲取數(shù)據(jù)文件：Acquisition Control- Setup- 上樣 -Acquire- 儀器獲取足夠細(xì)胞后，自動保存數(shù)據(jù)文件（data file ） 。11.3.7 調(diào)節(jié)FSC/CD3 PE中R1的位置準(zhǔn)確地圈定好需要分析的細(xì)胞；并同時調(diào)節(jié)HLA-B27/Counts中的M1,把所有細(xì)胞出現(xiàn)白峰全部圈

44、?。?His-Stats統(tǒng)計表中統(tǒng)計出 B27的平均熒光，得出分析結(jié)果。11.3.8 輸入相關(guān)信息，保存并打印統(tǒng)計結(jié)果，退出程序。12 .DNA測定12.3 材料和試劑12.1.1 抗凝外周血；12.1.2 DNA QC Particle , DNA測定質(zhì)量控制試齊U盒（ BD公司,349523） CEN刃、雞紅細(xì)胞核，CTN小牛胸腺細(xì)胞核，2dm的熒光微球，核酸染料PI。12.1.3 CycleTEST PLUS DNA ReagentKit試劑A,試劑B,試劑C,緩沖液12.2 樣本制備12.2.1 質(zhì)控樣本的制備（DNA QC Particle ）CEN:輕輕搖勻后，吸取 40 dL到1

45、mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘，即可上機。CTN:大力震蕩試劑瓶，吸取 40 dL至ij 1mL PI中，混勻室溫避光放置10分鐘即可上機檢測。12.2.2 外周血 DNA羊本的制備（Cycle TEST PLUS DNA Reagent Kit ）12.2.2.1 將100d L抗凝外周血全 加入17100-mm 的管中12.2.2.2 加入1的溶血素2ml,混勻，室溫放置 10分鐘12.2.2.3 室溫 300 g 離心 5 分鐘，吸去上清液12.2.2.4 加入2mlPBS洗滌細(xì)胞1次，室溫300 g 離心5分鐘，吸取上清液12.2.2.5 加入250 d L A液，輕輕混勻，不

46、要震蕩，室溫靜置10分鐘12.2.2.6 加入250 d L B液，輕輕混勻，不要震蕩，室溫靜置10分鐘12.2.2.7 加入250d L C液，輕輕混勻，不要震蕩，低溫（28C）避光靜置10分鐘12.2.2.8 用50 dm尼龍網(wǎng)膜或35 dm細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞12.2.2.9 低溫避光放置以待上機檢測。建議在加入C液后3小時內(nèi)上機，上機前輕輕混勻細(xì)胞懸液。12.3 .Acquisition ：用 CellQuest/CellQuest Pro 軟件獲取數(shù)據(jù)12.3.1 打開獲取模板（ACQt件）或制作新模板：圖 1 ：選擇點圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點圖對話框或Inspecto

47、r 中，選擇：Acquisition 獲取；X Parameter 橫軸參數(shù)：FSC 丫 Parameter 縱軸參數(shù)：SSC OK-出現(xiàn)相應(yīng)的點 圖。圖 2 ：選擇點圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的點圖對話框或Inspector 中，選擇：Acquisition 獲?。籜 Parameter 橫軸參數(shù)：FL2-W; Y Parameter 縱軸參數(shù)：FL2-A; OK-出現(xiàn)相應(yīng) 的點圖。圖3：選擇直方圖，在窗口拖出大小合適的方框，在出現(xiàn)的直方圖對話框或Inspector 中，選擇：Acquisition 獲取；X Parameter橫軸參數(shù)：FL2-A ; OK-出現(xiàn)相應(yīng)的直方圖。在本

48、圖橫軸 200和400 的位置分別設(shè) M門，標(biāo)為 M1和M2;對此圖進(jìn)行統(tǒng)計（Stats-Histogram Stats ）,對M1和M2進(jìn)行 統(tǒng)計 :File name,Marker,%Gate,Mean,CV 。三個圖形都設(shè)置完畢，F(xiàn)ile中選擇SAVE AS,保存模板ACQ文件。12.3.2 聯(lián)機 Acquire-Connect to cytometer ，出現(xiàn) Acquisition Control 窗口，出現(xiàn)AcquisitionControl 和 Browser 窗口，先將Browser 窗口最小化；12.3.3 數(shù)據(jù)獲取前的設(shè)定：Acquire-Accquisition Storage- 設(shè)定獲取細(xì)胞數(shù)（20000） -OK；Acquire-Parameter Discription 對話框（Browser 窗口最大化）選擇：-Directory :單擊Change設(shè)定存儲數(shù)據(jù)文件的文件夾；-File ： 設(shè)定數(shù)據(jù)文件的名字：文件前綴 （ Prefix ） - 自定義； 文件后綴（ Surfix ） - 管號 （設(shè)為 1 ） ，單擊OK；