細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)篇

1、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)篇基礎(chǔ)篇-無(wú)菌操作基本技術(shù)1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)（laminar flow）以紫外燈照射 30-60分鐘滅菌，以 70% ethanol擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工 作臺(tái)，以70% ethanol擦拭無(wú)菌操作抬面。 操作間隔應(yīng)讓無(wú)菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放70% ethanol擦拭后才帶入無(wú)菌操作臺(tái)2. 無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架

2、、 置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以 內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無(wú)菌區(qū)域，勿在邊緣之非無(wú)菌區(qū)域操作。3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人類(lèi)或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無(wú)菌操作臺(tái)（至少Class II）。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起aerosol （懸浮顆粒）之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳

3、針頭之傷害等。5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：5.1. CO2鋼瓶之CO2壓力。5.2. CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染（水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換）。5.3. 無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)之 airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過(guò)濾膜，預(yù)濾網(wǎng)（300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)， 3000 小時(shí) /HEPA）。6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。基礎(chǔ)篇-實(shí)驗(yàn)用品1. 種類(lèi)：1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與Pasteur pipet（巴斯的吸管）外，其它均為塑料無(wú)菌制品。1.2. TC級(jí)培養(yǎng)盤(pán)表面均有 coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種

4、類(lèi)有Tflask， plates, dishes,roller bottle等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。1.3. P lastic sterile pip et: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml1.4. 塑料離心管：15 ml, 50 ml，均有2種不同材質(zhì)，其中poly prop yle ne （PP）為不透明材質(zhì)，polystyre ne （PS）為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。1.5. glass pastuer pipet: 9 inch ,用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware） : 100ml

5、， 250ml， 500ml， 1000ml。2. 清洗：2.1. 新購(gòu)玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開(kāi)始使用。2.2. 用過(guò)之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑 清洗。3. 滅菌：3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 C, 15 lb, 20分鐘，置于oven中烘干。3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃Pasteur pipet以干熱滅菌170C , 4小時(shí)。3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypo chloride溶液（次氯酸，即漂白水）或是蒸汽高壓滅菌 121 C ,15 lb, 20分鐘處理。

6、基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基1. 液體培養(yǎng)基貯存于 4C冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37C水槽中溫?zé)帷?. 液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個(gè)月，期間glutamine可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添力口適量 glutamine。3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：3.1 .細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加 10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml, pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將 NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH之誤差，或局部過(guò)堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用 CO2氣體調(diào)整pH,而非用強(qiáng)酸(HCI)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)?氯離子對(duì)細(xì)胞生

7、長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。3.2. 材料：純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器，無(wú)菌血清瓶，0.1或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜，pH計(jì)，真空泵，CO2氣體3.3. 步驟：3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于 700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。3.3.2. 稱(chēng)取適量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和， 約3-5分鐘。3.3.3. 將溶解且含飽和 CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H應(yīng)為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否

8、則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過(guò)過(guò)濾膜時(shí)，pH會(huì)升高0.1-0.2。3.3.4. 以0.1或0.2 mm無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾滅菌，同時(shí)分裝至無(wú)菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類(lèi)、日期、瓶號(hào)等，貯存于4C。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾)3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長(zhǎng)試驗(yàn)與污染測(cè)試。附-配制培養(yǎng)基之生長(zhǎng)測(cè)試材料：MDCK cell (ATCC CCL-34或 CCRC 60004)6-well TC plate (or 35 mm TC dish)metha nolglacial acetic acid10 % Giemsa solutio n (Gibc

9、oBRL 10092-013)步驟：1. 以待測(cè)試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish)中，每個(gè)well接種1 X 102活細(xì)胞，同時(shí)作對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。2. 接種57天后，在100倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長(zhǎng)，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。3. 去除培養(yǎng)基，加入 1 ml Carnoy ' s固定液(甲醇：冰醋酸= 3:1)，室溫下靜置10 min。4. 去除固定液，水洗二次。5. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution ,室溫下靜置染色 2-3 min。6. 去除染液，水洗二

10、次。7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號(hào)的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，則丟棄之。基礎(chǔ)篇-抗生素1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素1.1. 培養(yǎng)自ATCC引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze通過(guò)污染測(cè)試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。2. 寄送活細(xì)胞時(shí)， 須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask 時(shí)，貝y須添加抗生素 (penicillin 100 units/ml + streptomycin100 ug/ml)。3. 若要檢測(cè)mycoplasma （支原體），則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加genta

11、micin （慶大霉素），因gentamicin會(huì)抑制 mycopiasma 生長(zhǎng)。4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 新霉素250ug/ml, bacitracin枯草桿菌抗生素2.5units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。5. 抗生素使用種類(lèi)與濃度：Penicillin(青霉素)Streptomycin (鏈霉素) chlotetracycii ne(chloramphenicol 氯霉素) gentamicin (慶大霉素) amphotericin B 兩性霉素 B

12、nystatin制霉菌素 fungizone兩性霉素B工作濃度.儲(chǔ)存溫度.1-20 C-20 C100 un its/mi100 ug/ml50 ug/ml-20 C殺滅細(xì)菌G(+) bacteriaG(+) and G(-) bacteriaG(+) and G(-) bacteria50 ug/ml-20 C2.5 ug/ml50 ug/ml2.5ug/mlG(+) and G(-) bacteria, mycop lasma-20 C-20 C-20 Cyeast and molds 霉菌yeast and moldsyeast and molds基礎(chǔ)篇-血清如果一次無(wú)法用完一瓶， 可將

13、401.血清必須貯存于-20 70 C,若存放于4 C,請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。45ml分裝于無(wú)菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 % ,必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否2. 一般廠商提供之血清為無(wú)菌,不需再無(wú)菌過(guò)濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾，勿直接過(guò)濾血清。I3. 瓶裝（500ml）血清解凍步驟（逐步解凍法）：-20C或-70C至4C冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無(wú)菌離心管可分裝 4045 ml。在溶解過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由-20C直接至37C解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)

14、凝一結(jié)而發(fā)生沈淀。I4. heat-inactivation （熱滅活） 是指56C , 30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補(bǔ)體成份（compiement）去活化。除非必須,則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。般不建議作此熱處理，因?yàn)闀?huì)造成沉淀物之顯著增多，且會(huì)影響血清之品質(zhì)。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有：cytolytic activities （溶細(xì)胞活動(dòng)） contraction of smooth muscle （平滑肌收縮），release of histamine from mast cells and platelets （組氨從肥大纟田胞和血小板中

15、釋放），enhanced Phagocytosis （增強(qiáng)吞噬作用），chemotaxis and activation of lymphocytic andmacrophage cell type （淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)的趨化和激活）。5. 勿將血清置于37 C太久，若在37 C放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定之成份 亦會(huì)因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。6. 血清之沉淀物6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白（fibrin）造成，這些凝絮沉淀物不會(huì)影響血清本身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮

16、沉淀物，可用離心3000rpm, 5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過(guò)濾。不建議用過(guò)濾步驟去除這些 凝絮沈淀物，因?yàn)闀?huì)阻塞過(guò)濾膜。6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點(diǎn)”：通常經(jīng)過(guò)熱處理之血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點(diǎn)”，常會(huì)誤認(rèn)為血清遭受污染，而將血清放在37 C中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37C環(huán)境下，又會(huì)使此沉淀物增多，更會(huì)誤認(rèn)為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細(xì)菌之培養(yǎng)基檢測(cè)，又沒(méi)有 污染。一般而言，此小黑點(diǎn)應(yīng)不會(huì)影響細(xì)胞之生長(zhǎng)，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批號(hào)的血清。附-血清之生長(zhǎng)測(cè)試材料：MDCK cell （ATCC CCL-34或

17、 CCRC 60004）a-MEM (al pha modified mi nimal esse ntial medium, GibcoBRL 12000-022 )6-well TC plate (or 35mm TC dish)metha nolglacial acetic acid10 % Giemsa solutio n(GibcoBRL 10092-013)步驟：1. 以 a-MEM with 10 % FBS (已測(cè)試過(guò))培養(yǎng) MDCK 細(xì)胞于 T75 flask 至 80% con flue ncy。2. 以trypsin-EDTA處理細(xì)胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM制

18、成細(xì)胞懸浮液，并測(cè)細(xì)胞濃度。以不加血清之 a-MEM 稀釋細(xì)胞濃度為 1X 102活細(xì)胞數(shù)/ ml。3. 將1 ml細(xì)胞懸浮液接種入 6-well plate中，并另加入1 ml含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %)之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為 10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測(cè)試過(guò)之血清 同時(shí)進(jìn)行對(duì)照組試驗(yàn)。4. 37 oC , 5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群 落間不互相接觸即可。5. 去除培養(yǎng)基，加入 1 ml Carnoy &#

19、39; s固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，室溫下靜置10 min。6. 去除固定液，水洗二次。7. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution ,室溫下靜置染色2-3 min。8. 去除染液，水洗二次。9. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)10. 計(jì)算 SPE ( Serum Plating Efficiency ):SPE = ( no. of colo nies / well ) / 100 x 100 %11. 計(jì)算 RPE(Relative Plating Efficiency):SPE = total colo nies of six well (test) / Total colo

20、nies of six well (co ntrol) x100 %訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清,比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE,即可得知待測(cè)血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。置于-70 C保存之基礎(chǔ)篇-細(xì)胞傳代培養(yǎng)1:3至1:6，依細(xì)胞種類(lèi)而異。1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為2. 材料：2.1. 無(wú)菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco ' phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL21600-010)2.2. trypsin-EDTA solutio n (0.05% trypsin-0.53mM

21、EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062):以10ml分裝于15ml無(wú)菌離心管中，保存于-20C，使用前放在 37C水槽回溫。2.3. 新鮮培養(yǎng)基2.4. 無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶3. 步驟：3.1. 附著型細(xì)胞(adhere nt cell)3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。3.1.2. 用D-PBS洗滌細(xì)胞一至二次。3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2) , 37 C作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作

22、用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液|)。3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。3.2. 懸浮型細(xì)胞(suspension cell)3.2.1.吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5分鐘。3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常 培養(yǎng)條件培養(yǎng)。3.3. 融合瘤(hybridoma)3.3.1.有些hybridoma cell需培養(yǎng)三天以上才會(huì)產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)

23、基，則可能會(huì)失去抗體。因 此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置， 或分殖至新培養(yǎng)瓶中?；A(chǔ)篇-細(xì)胞冷凍保存1. 注意事項(xiàng)：1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(log phase)且存活率高之狀態(tài)，約為80- 90%致密度。1.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色(以0.22micronFGLP Telflon過(guò)濾或4 C避光保存，勿作多次解凍。Glycerol因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌

24、產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以510 ml小體積分裝，亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開(kāi)啟后一年內(nèi)使用，1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度：1.4.1. normal human fibroblast: 13*106 cells/mlhybridoma會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細(xì)胞濃度不要太高，某些24小時(shí)后死去。1.4.3. adhere nt tumor lin es: 57 x 106，依細(xì)胞種類(lèi)而異。Ade nocarci noma 解凍后須較高之濃度，而 HeLa只需 1-3 x 106cells/m

25、l。1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少 5 x 106cells/ml。1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5或10% DMSO，若是不確定細(xì)胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時(shí)，亦應(yīng)作一個(gè)backup culture，以防止冷凍失敗。1.6. 冷凍方法：1.6.1. 傳統(tǒng)方法：4C 10分鐘->-20 C 30 分鐘->-80 C 16-18 小時(shí)(或隔夜)-> 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機(jī)以-1-3 C /分鐘之速度由室溫降至-120 C,

26、放在液氮槽vaporphase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。2. 材料：2.1. 生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞2.2. 新鮮培養(yǎng)基2.3. DMSO (Sigma D-2650)2.4. 無(wú)菌塑料冷凍保存管 (Nalgene 5000-0020)2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)2.6. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)與蓋玻片2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)3. 步驟：3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-1

27、0 %，混合均勻，置于室溫下待用。(約0.1 ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸浮液活率。3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。3.5. 冷凍保存方法1:冷凍管置于4C 10分鐘7 -20C 30分鐘-80 C 1618小時(shí)(或隔夜)液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。:program 7:3.6. 冷凍保存方法2:冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中，再放入液氮槽中。程序?yàn)镠B CELL基

28、礎(chǔ)篇-冷凍細(xì)胞活化1.冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。（例如產(chǎn)生單株抗2. 細(xì)胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或特性表現(xiàn)才會(huì)恢復(fù)正常 體或是其它蛋白質(zhì)）。3. 材料：37 C恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無(wú)菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過(guò)程，此時(shí)蓋子易松掉。 將新鮮培養(yǎng)基置于 37 C水槽中回溫，回溫后噴以 70 %酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入37 C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融

29、化，以70% ethanol4. 步驟：4.14.24.34.4擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。4.5取出0.9 ml解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)（稀釋比例1:101:15），混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取 0.1 ml解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試。，般而言，大都不需5-10 ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.6解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑（例如DMSO或glycerol）,依細(xì)胞種類(lèi)而異,要立即去除冷凍保護(hù)劑。若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有 心1,000 rpm, 5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入4.7若不需立即去除冷凍保存劑

30、，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基?；A(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式（一）1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)，請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請(qǐng)立即通知。細(xì)胞株請(qǐng)盡速開(kāi)始 培養(yǎng)，或立即冷凍保存（置于-70 C,隔夜后，移到液氮）。2. 冷凍細(xì)胞解凍程序：2.1. 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕 大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類(lèi)，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)，務(wù) 必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。2.2. FBS （fetal bovine serum,胚牛血清）,CS （calf serum,小牛血

31、清）和 HS （horse serum,馬血清）,對(duì)細(xì)胞 而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單指定之血清種類(lèi)培養(yǎng)之。2.3. 將培養(yǎng)基置于37 C水槽中回溫，回溫后噴以70 %酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入 37 C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖 冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化后，以 70% ethanol擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。2.4. 依據(jù)細(xì)胞種類(lèi)和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入 T25或T75 flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37 C, 5

32、% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.5. 對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，1%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除,待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)?DMSO敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入5 - 10 ml培養(yǎng)基中，離心300 xg （約1000 rpm），5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入37 ° C， 5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。基礎(chǔ)篇-收到細(xì)胞的處理方式（二）T25 flask均加滿培養(yǎng)基。請(qǐng)檢查flask外觀，并于收到T25 fl

33、ask細(xì)胞時(shí)，處理方式為：1.于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細(xì)胞脫落死亡,顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和有無(wú)污染現(xiàn)象，若有任何問(wèn)題，不要打開(kāi)蓋子，請(qǐng)立即通知細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室。2.將原封之T25 flask靜置于37 ° C, 5 % CO2培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞回溫至 37 ° C,并讓運(yùn)送過(guò)程 中少數(shù)脫落的細(xì)胞可再附著生長(zhǎng)。隔天后，于無(wú)菌操作箱內(nèi)取出flask內(nèi)之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內(nèi)，依一般培養(yǎng)方式再將細(xì)胞置入培養(yǎng)箱中，或細(xì)胞已長(zhǎng)滿盤(pán)，則將細(xì)胞做傳代培養(yǎng)。附-細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試I1. 原理：1.1 .計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coulter COUnter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。1.2. 血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè) chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1 mm2大正方形，其中 4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1 mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。1.3