細胞培養(yǎng)基礎篇

1、細胞培養(yǎng)基礎篇基礎篇-無菌操作基本技術1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺（laminar flow）以紫外燈照射 30-60分鐘滅菌，以 70% ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工 作臺，以70% ethanol擦拭無菌操作抬面。 操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放70% ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架

2、、 置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以 內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少Class II）。操作過程中，應避免引起aerosol （懸浮顆粒）之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳

3、針頭之傷害等。5. 定期檢測下列項目：5.1. CO2鋼瓶之CO2壓力。5.2. CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。5.3. 無菌操作臺內之 airflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預濾網(wǎng)（300小時/預濾網(wǎng)， 3000 小時 /HEPA）。6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水?；A篇-實驗用品1. 種類：1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與Pasteur pipet（巴斯的吸管）外，其它均為塑料無菌制品。1.2. TC級培養(yǎng)盤表面均有 coating高分子物質以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種

4、類有Tflask， plates, dishes,roller bottle等，依實驗需要使用。1.3. P lastic sterile pip et: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml1.4. 塑料離心管：15 ml, 50 ml，均有2種不同材質，其中poly prop yle ne （PP）為不透明材質，polystyre ne （PS）為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。1.5. glass pastuer pipet: 9 inch ,用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware） : 100ml

5、， 250ml， 500ml， 1000ml。2. 清洗：2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑 清洗。3. 滅菌：3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121 C, 15 lb, 20分鐘，置于oven中烘干。3.2. 實驗用玻璃Pasteur pipet以干熱滅菌170C , 4小時。3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypo chloride溶液（次氯酸，即漂白水）或是蒸汽高壓滅菌 121 C ,15 lb, 20分鐘處理。

6、基礎篇-培養(yǎng)基1. 液體培養(yǎng)基貯存于 4C冰箱，避免光照，實驗進行前放在37C水槽中溫熱。2. 液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個月，期間glutamine可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添力口適量 glutamine。3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：3.1 .細胞培養(yǎng)基通常須添加 10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml, pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將 NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應分別溶解后才混合，然后用 CO2氣體調整pH,而非用強酸(HCI)或強堿(NaOH)，因為 氯離子對細胞生

7、長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。3.2. 材料：純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要)，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3，電磁攪拌器，無菌血清瓶，0.1或0.2 mm無菌過濾膜，pH計，真空泵，CO2氣體3.3. 步驟：3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于 700 ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。3.3.2. 稱取適量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和， 約3-5分鐘。3.3.3. 將溶解且含飽和 CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H應為7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否

8、則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO2氣體調整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH會升高0.1-0.2。3.3.4. 以0.1或0.2 mm無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4C。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。附-配制培養(yǎng)基之生長測試材料：MDCK cell (ATCC CCL-34或 CCRC 60004)6-well TC plate (or 35 mm TC dish)metha nolglacial acetic acid10 % Giemsa solutio n (Gibc

9、oBRL 10092-013)步驟：1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish)中，每個well接種1 X 102活細胞，同時作對照組實驗。2. 接種57天后，在100倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。3. 去除培養(yǎng)基，加入 1 ml Carnoy ' s固定液(甲醇：冰醋酸= 3:1)，室溫下靜置10 min。4. 去除固定液，水洗二次。5. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution ,室溫下靜置染色 2-3 min。6. 去除染液，水洗二

10、次。7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳，則丟棄之?；A篇-抗生素1. 細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素1.1. 培養(yǎng)自ATCC引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。2. 寄送活細胞時， 須將培養(yǎng)液充滿整個flask 時，貝y須添加抗生素 (penicillin 100 units/ml + streptomycin100 ug/ml)。3. 若要檢測mycoplasma （支原體），則培養(yǎng)基內不可添加genta

11、micin （慶大霉素），因gentamicin會抑制 mycopiasma 生長。4. 去除細菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 新霉素250ug/ml, bacitracin枯草桿菌抗生素2.5units/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。5. 抗生素使用種類與濃度：Penicillin(青霉素)Streptomycin (鏈霉素) chlotetracycii ne(chloramphenicol 氯霉素) gentamicin (慶大霉素) amphotericin B 兩性霉素 B

12、nystatin制霉菌素 fungizone兩性霉素B工作濃度.儲存溫度.1-20 C-20 C100 un its/mi100 ug/ml50 ug/ml-20 C殺滅細菌G(+) bacteriaG(+) and G(-) bacteriaG(+) and G(-) bacteria50 ug/ml-20 C2.5 ug/ml50 ug/ml2.5ug/mlG(+) and G(-) bacteria, mycop lasma-20 C-20 C-20 Cyeast and molds 霉菌yeast and moldsyeast and molds基礎篇-血清如果一次無法用完一瓶， 可將

13、401.血清必須貯存于-20 70 C,若存放于4 C,請勿超過一個月。45ml分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10 % ,必須預留此膨脹體積之空間，否2. 一般廠商提供之血清為無菌,不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內一起過濾，勿直接過濾血清。I3. 瓶裝（500ml）血清解凍步驟（逐步解凍法）：-20C或-70C至4C冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝 4045 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由-20C直接至37C解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質

14、凝一結而發(fā)生沈淀。I4. heat-inactivation （熱滅活） 是指56C , 30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份（compiement）去活化。除非必須,則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。般不建議作此熱處理，因為會造成沉淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。補體參與之反應有：cytolytic activities （溶細胞活動） contraction of smooth muscle （平滑肌收縮），release of histamine from mast cells and platelets （組氨從肥大纟田胞和血小板中

15、釋放），enhanced Phagocytosis （增強吞噬作用），chemotaxis and activation of lymphocytic andmacrophage cell type （淋巴細胞和巨噬細胞細胞形態(tài)的趨化和激活）。5. 勿將血清置于37 C太久，若在37 C放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份 亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。6. 血清之沉淀物6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白（lipoprotein）變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白（fibrin）造成，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮

16、沉淀物，可用離心3000rpm, 5min去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些 凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在37 C中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37C環(huán)境下，又會使此沉淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有 污染。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質，應立即停用，更換另一批號的血清。附-血清之生長測試材料：MDCK cell （ATCC CCL-34或

17、 CCRC 60004）a-MEM (al pha modified mi nimal esse ntial medium, GibcoBRL 12000-022 )6-well TC plate (or 35mm TC dish)metha nolglacial acetic acid10 % Giemsa solutio n(GibcoBRL 10092-013)步驟：1. 以 a-MEM with 10 % FBS (已測試過)培養(yǎng) MDCK 細胞于 T75 flask 至 80% con flue ncy。2. 以trypsin-EDTA處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM制

18、成細胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之 a-MEM 稀釋細胞濃度為 1X 102活細胞數(shù)/ ml。3. 將1 ml細胞懸浮液接種入 6-well plate中，并另加入1 ml含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %)之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為 10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清 同時進行對照組試驗。4. 37 oC , 5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群 落間不互相接觸即可。5. 去除培養(yǎng)基，加入 1 ml Carnoy &#

19、39; s固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，室溫下靜置10 min。6. 去除固定液，水洗二次。7. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution ,室溫下靜置染色2-3 min。8. 去除染液，水洗二次。9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)10. 計算 SPE ( Serum Plating Efficiency ):SPE = ( no. of colo nies / well ) / 100 x 100 %11. 計算 RPE(Relative Plating Efficiency):SPE = total colo nies of six well (test) / Total colo

20、nies of six well (co ntrol) x100 %訂購多量同一批號的優(yōu)良血清,比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE,即可得知待測血清對細胞生長的影響。置于-70 C保存之基礎篇-細胞傳代培養(yǎng)1:3至1:6，依細胞種類而異。1. 細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為2. 材料：2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco ' phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL21600-010)2.2. trypsin-EDTA solutio n (0.05% trypsin-0.53mM

21、EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062):以10ml分裝于15ml無菌離心管中，保存于-20C，使用前放在 37C水槽回溫。2.3. 新鮮培養(yǎng)基2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶3. 步驟：3.1. 附著型細胞(adhere nt cell)3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。3.1.2. 用D-PBS洗滌細胞一至二次。3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2) , 37 C作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作

22、用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液|)。3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。3.2. 懸浮型細胞(suspension cell)3.2.1.吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5分鐘。3.2.2. 吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常 培養(yǎng)條件培養(yǎng)。3.3. 融合瘤(hybridoma)3.3.1.有些hybridoma cell需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)

23、基，則可能會失去抗體。因 此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置， 或分殖至新培養(yǎng)瓶中?；A篇-細胞冷凍保存1. 注意事項：1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase)且存活率高之狀態(tài)，約為80- 90%致密度。1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。1.3. 注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micronFGLP Telflon過濾或4 C避光保存，勿作多次解凍。Glycerol因長期儲存后對細胞會有毒性。是直接購買無菌

24、產(chǎn)品，如Sigma D-2650)，以510 ml小體積分裝，亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，1.4. 冷凍保存之細胞濃度：1.4.1. normal human fibroblast: 13*106 cells/mlhybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍1.4.2. hybridoma: 13 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些24小時后死去。1.4.3. adhere nt tumor lin es: 57 x 106，依細胞種類而異。Ade nocarci noma 解凍后須較高之濃度，而 HeLa只需 1-3 x 106cells/m

25、l。1.4.4. other suspensions: 510 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少 5 x 106cells/ml。1.5. 冷凍保護劑濃度為5或10% DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。1.6. 冷凍方法：1.6.1. 傳統(tǒng)方法：4C 10分鐘->-20 C 30 分鐘->-80 C 16-18 小時(或隔夜)-> 液氮槽 vapor phase 長期儲存。1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以-1-3 C /分鐘之速度由室溫降至-120 C,

26、放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。2. 材料：2.1. 生長良好之培養(yǎng)細胞2.2. 新鮮培養(yǎng)基2.3. DMSO (Sigma D-2650)2.4. 無菌塑料冷凍保存管 (Nalgene 5000-0020)2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)3. 步驟：3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為5-1

27、0 %，混合均勻，置于室溫下待用。(約0.1 ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存3.3. 依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液活率。3.4. 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。3.5. 冷凍保存方法1:冷凍管置于4C 10分鐘7 -20C 30分鐘-80 C 1618小時(或隔夜)液氮槽vapor phase長期儲存。:program 7:3.6. 冷凍保存方法2:冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為HB CELL基

28、礎篇-冷凍細胞活化1.冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。（例如產(chǎn)生單株抗2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常 體或是其它蛋白質）。3. 材料：37 C恒溫水，新鮮培養(yǎng)基，無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶，液氮或干冰容器操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 將新鮮培養(yǎng)基置于 37 C水槽中回溫，回溫后噴以 70 %酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。取出冷凍管，立即放入37 C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融

29、化，以70% ethanol4. 步驟：4.14.24.34.4擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。4.5取出0.9 ml解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內（稀釋比例1:101:15），混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取 0.1 ml解凍細胞懸浮液作存活測試。，般而言，大都不需5-10 ml培養(yǎng)基之離心管內，離 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.6解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol）,依細胞種類而異,要立即去除冷凍保護劑。若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有 心1,000 rpm, 5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入4.7若不需立即去除冷凍保存劑

30、，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基?；A篇-收到細胞的處理方式（一）1. 收到細胞株包裹時，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即通知。細胞株請盡速開始 培養(yǎng)，或立即冷凍保存（置于-70 C,隔夜后，移到液氮）。2. 冷凍細胞解凍程序：2.1. 依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕 大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因實驗需要，必須有所不同時，務 必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細胞適應后，方進行所需之實驗。2.2. FBS （fetal bovine serum,胚牛血清）,CS （calf serum,小牛血

31、清）和 HS （horse serum,馬血清）,對細胞 而言差異極大，請務必依據(jù)細胞株資料單指定之血清種類培養(yǎng)之。2.3. 將培養(yǎng)基置于37 C水槽中回溫，回溫后噴以70 %酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。取出冷凍管，立即放入 37 C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖 冷凍管使其在1分鐘內全部融化后，以 70% ethanol擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內。2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入 T25或T75 flask內之培養(yǎng)基，混合均勻，放入37 C, 5

32、% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.5. 對絕大多數(shù)細胞而言，1%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除,待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數(shù)因對 DMSO敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml培養(yǎng)基中，離心300 xg （約1000 rpm），5分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后，轉移至培養(yǎng)瓶中，再放入37 ° C， 5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)?；A篇-收到細胞的處理方式（二）T25 flask均加滿培養(yǎng)基。請檢查flask外觀，并于收到T25 fl

33、ask細胞時，處理方式為：1.于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡,顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象，若有任何問題，不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。2.將原封之T25 flask靜置于37 ° C, 5 % CO2培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至 37 ° C,并讓運送過程 中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask內之培養(yǎng)基，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml培養(yǎng)基于flask內，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中，或細胞已長滿盤，則將細胞做傳代培養(yǎng)。附-細胞計數(shù)與存活測試I1. 原理：1.1 .計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter COUnter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個 chambers，每個chamber中細刻9個1 mm2大正方形，其中 4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞數(shù)目。1.3