玉米A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因ZmbZIP81的克隆、表達(dá)與功能分析

1、1 玉米A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因ZmbZIP81的克隆、表達(dá)與功能分析 王 策1,2 楊艷歌2,3 呂維濤2,* 周春菊1,* 孫冬梅3 鄧 馨2 1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100；2 中國科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；3 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶163319 摘 要：堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)蛋白是真核生物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于植物在逆境下的基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用。為豐富對(duì)玉米bZIP轉(zhuǎn)錄因子功能的認(rèn)識(shí)，本研究以從玉米中克隆到的一個(gè)A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子編碼基因ZmbZ

2、IP81為對(duì)象展開。ZmbZIP81基因位于玉米第6染色體，編碼區(qū)全長2492 bp，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，編碼蛋白含254個(gè)氨基酸。研究表明ZmbZIP81基因表達(dá)受外源ABA、NaCl和干旱脅迫誘導(dǎo)。過表達(dá)該基因的擬南芥植物表現(xiàn)出ABA不敏感和NaCl脅迫抗性增強(qiáng)的表型，推測ZmbZIP81可能作為ABA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子參與植物抗逆基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 關(guān)鍵詞：玉米；bZIP轉(zhuǎn)錄因子；A亞族；ABA；逆境脅迫 Cloning, Expression, and Functional Analysis of an A Subfamily bZIP Transcription Fact

3、or Gene ZmbZIP81 in Maize WANG Ce1,2, YANG Yan-Ge2,3, LÜ Wei-Tao2,*, ZHOU Chun-Ju1,*, SUN Dong-Mei3, and DENG Xin2 1 College of Life Science, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, China; 2 Key Laboratory of Plant Resources, Institute of Botany, Chinese Academy of Sci

4、ences, Beijing 100093, China; 3 College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China Abstract: Basic leucine zipper (bZIP) proteins constitute a large family of transcription factors among eukaryotes, which plays important roles in gene expression r

5、egulation under abiotic stress in plants. In order to gain a better understanding of bZIPs in maize, we cloned ZmbZIP81 from maize, which encodes an A subfamily bZIP transcription factor. ZmbZIP81 is located on chromosome 6. The coding region of ZmbZIP81 is 2492 bp in length with four exons and thre

6、e introns, which encodes 254 animo acid residues. Further study showed that the expression of ZmbZIP81 was induced by exogenous ABA, salt and drought treatments. The transgenic Arabidopsis plants overexpressing ZmbZIP81 were less sensitive to ABA, but more tolerant to salt, compared with the wild ty

7、pe. These results indicated that ZmbZIP81 may encode a transcription factor, regulate ABA signaling negatively and participate in abiotic stress tolerance regulation in maize. Keywords: Maize; bZIP transcription factor; A subfamily; ABA; Abiotic stress bZIP轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，參與多種生物學(xué)過程。它是轉(zhuǎn)錄因子中一個(gè)較大的基因家

8、族，所有成員均由一個(gè)起二聚體化作用的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域和一個(gè)結(jié)合DNA的堿性結(jié)構(gòu)域組成1。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域能夠形成一個(gè)具有兩親性的螺旋，通過形成二聚體與DNA結(jié)合。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域再通過一個(gè)固定的N-x7-R/K結(jié)構(gòu)專一性地識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子上的順式作用元件。此外，bZIP轉(zhuǎn)錄因子一般還含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合后起加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用2。研究表明，植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子通過參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)多種非生物脅迫，如鹽脅迫、干旱脅迫、熱脅迫等3。擬南芥 本研究由國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2011ZX08009-002)資助。 * 通訊作者(Corresponding a

9、uthors): 呂維濤, E-mail: wtlv, Tel: 周春菊, E-mail: zhchju 第一作者聯(lián)系方式: E-mail: wangce_, Tel:Received(收稿日期): 2014-01-21; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2014-06-27. URL: 2 (Arabidopsis thaliana) 中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族共有75個(gè)成員，可以根據(jù)其堿性亮氨酸拉鏈的同源性和其他保守域的序列特征的不同分為10個(gè)亞族，A亞族bZIPs

10、主要在種子和植物組織對(duì)ABA和逆境脅迫的響應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用4-5。如ABI5蛋白是ABA抑制種子萌發(fā)和幼苗生長過程中的重要信號(hào)組分，受ABA、干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，能提高植物對(duì)外源ABA的敏感性，在干旱條件下參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)植物抗逆性起重要作用6。與擬南芥ABI5相似，水稻(Oryza sativa L.)中的OsABI5能抑制種子萌發(fā)和幼苗生長，可以與G-box元件結(jié)合并激活抗逆基因的表達(dá)7。在種子發(fā)育期，AtABI5和OsABI5均可通過對(duì)ABA的感知誘導(dǎo)胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因的表達(dá)7。 玉米(Zea mays L.)是重要的糧食作物。然而隨著生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，土壤鹽

11、漬化已成為影響玉米生長發(fā)育和結(jié)實(shí)的一大危害，嚴(yán)重制約了作物產(chǎn)量8。在一些鹽漬化地區(qū)種植的玉米往往表現(xiàn)為出苗時(shí)間延遲、發(fā)芽率降低、光合作用受抑并導(dǎo)致產(chǎn)量降低9。因此，提高植物的抗鹽性、增加鹽脅迫下作物產(chǎn)量成為備受人們關(guān)注的課題。bZIP轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物逆境基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用，已在玉米研究中受到關(guān)注。Wei等10利用玉米基因組數(shù)據(jù)庫鑒定出125個(gè)bZIP基因，編碼170種蛋白，通過序列分析將其劃分為11個(gè)亞族，并按染色體中的定位順序?qū)⑵涿?。Ying等11和Yan等12對(duì)玉米A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子ZmABI5和ZmbZIP72的研究表明，它們的基因表達(dá)均受ABA與逆境脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，過表達(dá)Zmb

12、ZIP72使擬南芥轉(zhuǎn)基因株系對(duì)ABA的敏感性增強(qiáng)，且抗旱、抗鹽；但過表達(dá)ZmABI5卻導(dǎo)致擬南芥轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽、旱、高溫和低溫脅迫更為敏感。A亞族中bZIP轉(zhuǎn)錄因子從系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系上可被進(jìn)一步分為3個(gè)分支，ZmbZIP72與ABI5和OsbZIP72等構(gòu)建在同一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化分支上11，而另外兩個(gè)分支上的bZIP13/GBF4、bZIP14/27等在玉米中的同源基因功能尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步探究玉米A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子在ABA信號(hào)途徑與逆境脅迫響應(yīng)中的作用，本文對(duì)從ZmGDB (/ZmGDB/)數(shù)據(jù)庫搜索到的一個(gè)與擬南芥GBF4和AtbZIP13基因有較高

13、同源性的、被Wei等10命名為ZmbZIP81的基因進(jìn)行克隆，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了ZmbZIP81在玉米中的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式，并通過分析過表達(dá)該基因的擬南芥植物表型探討了ZmbZIP81在ABA信號(hào)途徑和逆境脅迫抗性中的作用。本研究結(jié)果對(duì)于研究玉米響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的機(jī)制、培育抗鹽玉米新品種具有參考價(jià)值。 1 材料與方法 1.1 玉米材料及處理 將玉米B73自交系種子置蒸餾水浸濕的紗布上，于28暗培養(yǎng)2 d后，種植于盛有攪拌均勻的花土和蛭石的小花盆中，在28、12 h/12 h光周期條件下培養(yǎng)。參考Ying等11的ABA、NaCl和干旱處理方法并加以改進(jìn)：取三葉一心期的幼苗，將根部浸沒在

14、100 mol L1 ABA和150 mmol L1 NaCl溶液中，并以溶劑浸根為對(duì)照，分別于處理0、2、6和12 h后取樣；另從土中取出同時(shí)期幼苗，在室溫下自然干燥，分別于植株失水量達(dá)到鮮重的20%、40%和60%時(shí)取樣，并取土壤中正常生長的植株葉片為對(duì)照。將各組樣品立即用液氮冷凍并于70保存。 1.2 RNA提取及第一鏈cDNA的合成 用總RNA提取試劑盒(TRIzol Reagent, TaKaRa)提取樣品總RNA，并用DNase I (TaKaRa)純化。按照SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)說明書合成第一鏈cDNA，作為基因擴(kuò)增及熒光定量PCR (Re

15、al-time quantitative PCR, qRT-PCR)的模板。 1.3 ZmbZIP81基因的克隆 以正常條件下生長的三葉一心期B73自交系玉米幼苗的cDNA為材料，用基因特異性引物ZmbZIP81-F和ZmbZIP81-R (表1)和高保真的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(NEB)進(jìn)行基因擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?8預(yù)變性30 s，之后進(jìn)入循環(huán)程序98 10 s, 62 20 s, 72 45 s，退火溫度每隔一個(gè)循環(huán)降低1，至49，最后72延伸10 min的Touchdown程序。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的條帶。產(chǎn)物連接Gateway載體

16、pENTR/D-TOPO (Invitrogen)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)TOP10，經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆，3 測序驗(yàn)證。測序正確的中間載體通過LR反應(yīng)(LR克隆酶，Invitrogen)將擴(kuò)增片段連入植物表達(dá)載體pLeela (Invitrogen)，測序驗(yàn)證。 1.4 DNA與蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析 利用ZmGDB (/ZmGDB/)數(shù)據(jù)庫搜索ZmbZIP81基因及其所編碼的蛋白序列，并通過PlantCARE (http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線服務(wù)器查找

17、并分析其啟動(dòng)子區(qū)ABA與脅迫相關(guān)信號(hào)響應(yīng)元件。利用tair (/)數(shù)據(jù)庫查找擬南芥中A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。使用ClustalX 2.0對(duì)ZmbZIP81和擬南芥A亞族bZIP蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)13，用GeneDoc對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行保守序列分析，用MEGA5構(gòu)建由Bootstrap檢測(1000次抽樣)的系統(tǒng)發(fā)育樹14。利用MEME ( 1.5 玉米苗期ZmbZIP81基因在脅迫條件下的表達(dá) 以ABA、NaCl和干旱處理?xiàng)l件下的三葉一心期B73自交系玉米幼苗和對(duì)照組的cDNA為材料，采用Toyobo公司SYBR Green Master

18、 Mix進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系含cDNA 1 L、2×SYBR Green Master Mix 7.5 L、引物(10 pmol L1)各0.3 L、ddH2O 5.9 L。以玉米-tubulin為內(nèi)參，以qRT-ZmbZIP81-F和qRT-ZmbZIP81-R，qRT-tubulin-F和qRT-tubulin-R (表1)為引物，用Eppendorf公司Realplex PCR儀實(shí)時(shí)定量檢測基因表達(dá)。反應(yīng)程序?yàn)?4預(yù)變性30 s，之后94 5 s, 55 30 s, 72 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2Ct法分析基因相對(duì)表達(dá)量16。 表1 所用引物 Table 1

19、Primers used in this study 引物 Primer 引物序列 Sequence information (5¢3¢) 用途 Function ZmbZIP81-F CACCGACTGTCTGAAGTTTTGCCC 基因克隆 ZmbZIP81-R CACGCACAATCACCTAAATGTTTTC Gene Cloning qRT-ZmbZIP81-F CTAGGGACAGGAAACAGGCC 熒光定量PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR qRT-ZmbZIP81-R TACCATTCCATGGAGTTGTTTC Real-time PCR, RT-PCR qRT-tu

20、bulin-F GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA 玉米內(nèi)參照基因 qRT-tubulin-R CGCCAAACTTAATAACCCAGTA Reference gene as control in maize RT-actin7-F CCGGTATTGTGCTCGATTCTG 擬南芥內(nèi)參照基因 RT-actin7-R TTCCCGTTCTGCGGTAGTGG Reference gene as control in Arabidopsis 1.6 ZmbZIP81轉(zhuǎn)基因擬南芥純合株系的獲得與驗(yàn)證 將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101 (pMP90RK)，得到的陽性菌克隆經(jīng)PCR

21、驗(yàn)證后采用浸花法侵染野生型擬南芥(Col)植株，收獲成熟T0代種子。T0代種子經(jīng)消毒后，點(diǎn)播在MS選擇培養(yǎng)基(含100 g mL1草甘膦)上篩選抗性植株，種植收種。在相同選擇培養(yǎng)基上篩選T1代種子抗性與非抗性植株符合31分離比例的單株，經(jīng)一代種植后選擇在相同選擇培養(yǎng)基上不發(fā)生分離的T2代抗性株系種子進(jìn)行進(jìn)一步分析。 為分析轉(zhuǎn)基因株系中ZmbZIP81的表達(dá)量，將各轉(zhuǎn)基因株系與野生型種子播于MS培養(yǎng)基上，4春化3 d后，在22、16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)10 d，取整株幼苗如前述方法提取總RNA，并合成第一鏈cDNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為cDNA 1 L、2×Taq

22、Mix 5 L、引物 (10 pmol L1) 各0.5 L、ddH2O 3 L。以擬南芥Actin7為內(nèi)參，用引物qRT-ZmbZIP81-F和qRT-ZmbZIP81-R、RT-actin7-F和RT-actin7-R (表1)分別擴(kuò)增ZmbZIP81基因序列和內(nèi)參序列，反應(yīng)程序?yàn)?4預(yù)變性30 s，之后94 10 s, 55 30 s, 72 20 s，共25個(gè)循環(huán)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收與測序驗(yàn)證。 1.7 ZmbZIP81轉(zhuǎn)基因擬南芥ABA敏感性和抗鹽性分析 參考Ying等11的ABA和NaCl處理方法并加以改進(jìn)。將T2代轉(zhuǎn)ZmbZIP81基因的擬南芥與野生型種子以70%酒精30

23、s、7% NaClO 15 min消毒后分別播于含5 mol L1 ABA及200 mmol L1 NaCl的MS培養(yǎng)基上，以未加ABA和NaCl的MS培養(yǎng)基為對(duì)照，4春化3 d后，在22、16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)并于每24 h統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，總共統(tǒng)計(jì)7 d。另將轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型種子經(jīng)同樣方法消毒后播于MS培養(yǎng)基上，4春化3 d后，在22、16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)3 d，選取長勢相同的幼苗分別移至含有50 mol 4 L1 ABA及150 mmol L1 NaCl的MS培養(yǎng)基上，以未加ABA和NaCl的MS培養(yǎng)基為對(duì)照，生長一段時(shí)間后觀察轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的表型差異。 2

24、結(jié)果與分析 2.1 ZmbZIP81序列分析 ZmbZIP81基因位于玉米第6號(hào)染色體，編碼區(qū)全長2492 bp，具有4段外顯子區(qū)和3段內(nèi)含子區(qū)，編碼254個(gè)氨基酸 (圖1-A)。除亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域外，ZmbZIP81蛋白還包含2個(gè)保守域Motif 1和Motif 2 (圖1-B)，它們是一些蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)。兩個(gè)保守域中各自包含鈣依賴的蛋白激酶(CDPK)等的結(jié)合位點(diǎn)R-X-X-S/T，以及酪蛋白激酶II (CK II)的結(jié)合位點(diǎn)S/T-X-X-E/D。此外，對(duì)ZmbZIP81基因的啟動(dòng)子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)分別位于-751 bp和-460 bp的ABRE元件、1個(gè)位于-1051 bp的干旱脅迫

25、信號(hào)響應(yīng)的DRE元件和1個(gè)位于-133 bp的MYB類轉(zhuǎn)錄因子特異性識(shí)別的CCAAT-box元件(圖1-A)，表明該基因的表達(dá)可能受ABA與脅迫信號(hào)的調(diào)控。將ZmbZIP81的氨基酸序列與擬南芥中A亞族bZIPs進(jìn)行多重序列比對(duì)(圖2)，發(fā)現(xiàn)它們具有高度保守的序列和結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，ZmbZIP81與擬南芥中GBF4和AtbZIP13親緣關(guān)系最近(圖3)，且序列相似性最高，均為42%，而與ZmABI5和ZmbZIP72親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(未列出)。GBF4是一種能與基因啟動(dòng)子區(qū)G-box結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子4，但其具體功能還未見報(bào)道。 圖1 ZmbZIP81基因(A)與編碼蛋白(B)結(jié)構(gòu)示意圖

26、 Fig. 1 Gene structure of ZmbZIP81 (A) and conserved domains of the protein encoded (B) A B 5 圖2 ZmbZIP81和擬南芥A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子的多重序列比對(duì) Fig. 2 Alignment of ZmbZIP81 and A subfamily bZIP transcription factors in Arabidopsis 6 圖3 ZmbZIP81和擬南芥A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig. 3 Phylogenetic tree of ZmbZIP81 and A subfami

27、ly bZIPs in Arabidopsis 2.2 玉米苗期ZmbZIP81基因在脅迫條件下的表達(dá) 以三葉一心期玉米幼苗為材料，分析ZmbZIP81基因?qū)BA、NaCl和干旱處理的應(yīng)答表明，上述處理均可誘導(dǎo)ZmbZIP81的表達(dá)，并且隨處理時(shí)間的延長和程度的加重表達(dá)量逐漸升高(圖4)。經(jīng)ABA和NaCl分別處理12 h和6 h后，ZmbZIP81基因表達(dá)開始明顯上調(diào)，且兩種脅迫處理12 h后，ZmbZIP81表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組的近2倍(圖4-A, B)。ABA處理2 h時(shí)表達(dá)量雖有下降，經(jīng)分析與對(duì)照組無顯著性差異。干旱處理下，當(dāng)葉片失水率達(dá)到20%和40%時(shí)，ZmbZIP81表達(dá)量上調(diào)約1

28、.5倍；而失水率達(dá)到60%時(shí)，表達(dá)量可達(dá)初始水平的3.65倍(圖4-C)。說明ZmbZIP81基因的表達(dá)受ABA、NaCl和干旱脅迫的誘導(dǎo)。 圖4 ZmbZIP81基因在ABA、NaCl和干旱處理?xiàng)l件下的表達(dá) Fig. 4 Expression of ZmbZIP81 in maize under ABA, salt, and drought treatments A: ABA處理(100 mol L1); B: NaCl處理(150 mmol L1); C: 干旱處理。各處理?xiàng)l件下，ZmbZIP81基因的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的倍數(shù)。 A: Treatment of MS+ABA (100 mol

29、 L1); B: Treatment of MS+NaCl (150 mmol L1); C: Drought treatment. The relative expression level of ZmbZIP81 under each treatment represents fold change towards the control. 2.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證 為進(jìn)一步研究ZmbZIP81轉(zhuǎn)錄因子的功能，構(gòu)建了35SS:ZmbZIP81的植物表達(dá)載體，其結(jié)構(gòu)如圖5-A所示，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)抗生素篩選與基因組PCR驗(yàn)證獲得了純合單拷貝T2代過表達(dá)擬

30、南芥株系OE-5、OE-9和OE-11。半定量RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖5-B所示，在3個(gè)過表達(dá)株系中檢測到特異目的條帶，而在野生型擬南芥中未檢測到。所用引物的特異性已通過對(duì)PCR產(chǎn)物的切膠回收與測序進(jìn)行驗(yàn)證。以上結(jié)果表明ZmbZIP81確已轉(zhuǎn)化成功并獲得穩(wěn)定遺傳的株系。 012302612Time of ABA treatment (h)Relative expressionA012302612Time of NaCl treatment (h)Relative expressionB0123450204060Water lose rate (%)Relative expressionCA 7

31、 圖5 ZmbZIP81過表達(dá)載體示意圖(A)和35SS:ZmbZIP81轉(zhuǎn)基因株系的RT-PCR結(jié)果(B) Fig. 5 Structure of ZmbZIP81-overexpressed vector (A) and analysis of 35SS:ZmbZIP81 transgenic lines (B) p35SS: ZmbZIP81基因啟動(dòng)子; pA35S: ZmbZIP81基因終止子; Pat: 草甘膦抗性基因; Nos-p: 草甘膦抗性基因啟動(dòng)子; Nos-T: 草甘膦抗性基因終止子; attB1和attB2: LR反應(yīng)重組位點(diǎn); LB: 載體左邊界; RB: 載體右邊界。

32、 p35SS: promoter of ZmbZIP81; pA35S: terminator of ZmbZIP81; Pat: glyphosate resistance gene; Nos-p: promoter of glyphosate resistance gene; Nos-T: terminator of glyphosate resistance gene; attB1 and attB2: LR recombination sites; LB: left border; RB: right border. 2.4 過表達(dá)擬南芥對(duì)ABA的敏感性反應(yīng) 在B73自交系中，ZmbZ

33、IP81基因表達(dá)顯示出受ABA誘導(dǎo)上調(diào)的特性(圖4)。為驗(yàn)證ZmbZIP81的功能是否與ABA敏感性存在關(guān)聯(lián)，分析了過表達(dá)ZmbZIP81的擬南芥株系的ABA敏感性。如圖6-A, B所示，在5 mol L1 ABA處理下，3個(gè)過表達(dá)株系種子萌發(fā)率均顯著高于野生型，如OE-5、OE-9和OE-11轉(zhuǎn)基因株系在第7天的萌發(fā)率分別為56.5%、36.6%和56.9%，而野生型只有14.0%；在對(duì)照組培養(yǎng)基上生長的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型種子萌發(fā)率基本一致，表明過表達(dá)株系種子萌發(fā)對(duì)ABA的敏感性降低。另外，當(dāng)3 d苗齡的擬南芥幼苗移至含有50 mol L1 ABA的MS培養(yǎng)基上25 d后，野生型擬南芥黃

34、化較明顯，且部分植株已死亡，其平均根長為2.8 cm，存活率為61.9%；而3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片相對(duì)大而綠，幾乎全部存活，平均根長分別為2.9、3.9和4.5 cm，分析表明OE-9和OE-11兩株系根顯著長于野生型，3個(gè)株系的存活率分別為95.2%、100%和100%，同期的對(duì)照組幼苗長勢始終一致(圖7-A, B)。以上結(jié)果說明，在種子萌發(fā)期與幼苗期，與野生型相比，ZmbZIP81過表達(dá)擬南芥的ABA敏感性降低。因此推測ZmbZIP81可能作為ABA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子參與植物抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 圖6 ABA和NaCl處理?xiàng)l件下35SS:ZmbZIP81轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì) Fig. 6 G

35、ermination assays of 35SS:ZmbZIP81 transgenic lines of Arabidopsis under ABA and salt treatments A: MS培養(yǎng)基; B: ABA處理 (5 mol L1); C: NaCl處理 (200 mmol L1)。 A: MS medium; B: MS+ABA (5 mol L1); C: MS+NaCl (200 mmol L1). 2.5 過表達(dá)擬南芥的抗逆性 植物的抗逆性與ABA信號(hào)途徑密切相關(guān)。在逆境脅迫下，植物體可以通過改變內(nèi)源ABA水平調(diào)控逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性。

36、種子萌發(fā)期耐鹽性分析表明，在含有200 mmol L1 NaCl的MS培養(yǎng)基上，各植物株系的萌發(fā)率在第7天均可達(dá)到100%，但過表達(dá)株系種子萌發(fā)明顯快于野生型，如第4天OE-5、OE-9和OE-11三個(gè)株系萌發(fā)率分別為68.4%、84.9%和75.0%，而野生型只有54.2%，020406080100120123Days at MS medium (d)Germination (%) .ColOE-5OE-9OE-11A0204060801001201234567Days at 5 mol L-1 ABA (d)Germination (%) .ColOE-5OE-9OE-11B0204060

37、801001201234567Days at 200 mmol L-1 NaCl (d)Germination (%) .ColOE-5OE-9OE-11CCol OE-5 OE-9 OE-11 AtActin7 ZmbZIP81 B 8 經(jīng)檢測差異達(dá)到顯著水平；在只含有MS的對(duì)照組培養(yǎng)基上生長的3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與野生型種子萌發(fā)率基本一致，第2天即可達(dá)近100% (圖6-A, C)。而對(duì)過表達(dá)株系的幼苗期抗鹽脅迫能力檢測表明，在150 mmol L1 NaCl處理30 d后，各轉(zhuǎn)基因株系擬南芥幼苗長勢與野生型無明顯差異，抗鹽性基本一致(圖7-A, C)。以上結(jié)果說明，與野生型相比，ZmbZIP8

38、1過表達(dá)擬南芥對(duì)鹽脅迫的抗性有一定程度的提高，而這種抗性的提高只體現(xiàn)在種子萌發(fā)期，不體現(xiàn)于幼苗期。因此推測ZmbZIP81基因可能并不參與植物幼苗期的鹽脅迫反應(yīng)，而只在種子萌發(fā)期發(fā)揮抗鹽作用。我們還同時(shí)采用40% PEG-8000模擬的滲透脅迫分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)期與幼苗期的抗旱性，結(jié)果顯示，滲透脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型在種子萌發(fā)期以及幼苗期的長勢基本一致 (未列出)，表明ZmbZIP81基因在植物抗旱性方面可能無明顯作用。 圖7 ABA和NaCl處理?xiàng)l件下35SS:ZmbZIP81轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗期生長表型 Fig. 7 Photographs of 35SS:ZmbZIP81 tra

39、nsgenic lines in seedling stage under ABA and salt treatments A: MS培養(yǎng)基; B: ABA處理 (50 mol L1); C: NaCl處理 (150 mmol L1)。 A: MS medium; B: MS+ABA (50 mol L1); C: MS+NaCl (150 mmol L1). 3 討論 在干旱、高鹽等逆境條件下，植物細(xì)胞能夠迅速合成ABA。在內(nèi)源ABA誘導(dǎo)下，大量脅迫相關(guān)基因被表達(dá)，從而參與植物抗逆反應(yīng)。擬南芥中的A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子多數(shù)已被較為深入地研究，它們對(duì)于植物對(duì)ABA和外界脅迫響應(yīng)具有重要作用17

40、。已報(bào)道的幾個(gè)擬南芥中的A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，且作為正調(diào)控因子參與植物逆境脅迫響應(yīng)4，具有代表性的基因包括ABI5、ABI5-like、ABF1-4等。已報(bào)道的2個(gè)玉米A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子ZmABI5和ZmbZIP72均受ABA與逆境脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，且參與植物逆境脅迫響應(yīng)11-12。其中ZmbZIP72過表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植物對(duì)ABA的敏感性增強(qiáng)，且抗旱、抗鹽，但ZmABI5是作為負(fù)調(diào)控因子參與逆境下植物對(duì)鹽、旱、高溫和低溫等非生物脅迫的響應(yīng)12。 本研究從玉米中克隆到另一個(gè)A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因ZmbZIP81，并通過序列分析證明其編碼蛋白9 與擬南芥中A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子

41、具有相似的序列特征，它們都有1段保守的bZIP結(jié)構(gòu)域和2個(gè)保守性較高的基序，在系統(tǒng)進(jìn)化上與bZIP13/GBF4構(gòu)成一個(gè)分支，而與ZmABI5和ZmbZIP72親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也證明，ZmbZIP81雖與ZmABI5和ZmbZIP72具有類似的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式，但與它們在植物逆境脅迫抗性中的作用卻有所不同。ZmbZIP81轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)外源ABA敏感性降低，抗NaCl脅迫能力增強(qiáng)，表明它可能是ABA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子，但可提高植物抗逆性。這與Liao等18報(bào)道的幾個(gè)負(fù)調(diào)控模式的大豆bZIP轉(zhuǎn)錄因子GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78相似。這3個(gè)大豆轉(zhuǎn)錄因子分別

42、屬于S、C和G亞族，它們對(duì)ABA敏感性降低，對(duì)NaCl脅迫抗性增強(qiáng)，并且3個(gè)基因表達(dá)均受ABA、NaCl和干旱脅迫誘導(dǎo)，說明ZmbZIP81可能與3個(gè)大豆bZIP轉(zhuǎn)錄因子具有類似的調(diào)控模式。另外，在本實(shí)驗(yàn)中雖未發(fā)現(xiàn)ZmbZIP81基因?qū)χ参锟節(jié)B透脅迫能力的顯著影響，但基于ZmbZIP81基因的表達(dá)受干旱誘導(dǎo)，且較大幅度的表達(dá)量上調(diào)出現(xiàn)在植株失水量達(dá)到60%時(shí)，推測ZmbZIP81基因可能主要參與嚴(yán)重干旱脅迫的反應(yīng)，或者在干旱脅迫反應(yīng)中的功能需要其他調(diào)控形式、或其他調(diào)控因子的協(xié)同作用。此研究中，我們的主要目的是對(duì)比ZmbZIP81與ZmABI5和ZmbZIP72在基因表達(dá)和功能上的差異。由于Zm

43、ABI5和ZmbZIP72的表型主要集中在種子萌發(fā)和幼苗期，所以我們也重點(diǎn)關(guān)注這兩個(gè)階段。后續(xù)對(duì)植物生育后期的表型分析，尤其是在土壤干旱和鹽漬條件下植物的抗性以及利用關(guān)鍵bZIP轉(zhuǎn)錄因子缺失且對(duì)鹽害敏感的突變體進(jìn)行互補(bǔ)突變體表型驗(yàn)證，將有助于更加全面、深入地說明該基因的功能。 玉米作為單子葉作物，其逆境響應(yīng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可能與雙子葉植物擬南芥存在較大差異。目前有關(guān)玉米bZIP轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道還較少見，進(jìn)一步研究其各成員的功能對(duì)闡明它們參與依賴于ABA的逆境脅迫響應(yīng)信號(hào)通路的機(jī)制具有重要意義。鹽漬化土壤環(huán)境制約了玉米出苗時(shí)間與發(fā)芽率，并影響其產(chǎn)量9。因此，找到能提高玉米抗鹽性的關(guān)鍵基因?qū)τ谔岣哂衩桩a(chǎn)量至

44、關(guān)重要。本文報(bào)道的玉米bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因ZmbZIP81可明顯提高轉(zhuǎn)基因植物種子在鹽脅迫下的萌發(fā)速率，對(duì)通過分子育種手段改善玉米抗逆性進(jìn)而提高鹽漬化土壤種植玉米的產(chǎn)量具有參考價(jià)值。 4 結(jié)論 從玉米中克隆了一個(gè)編碼A亞族bZIP轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP81的基因。該基因的表達(dá)受ABA、NaCl和干旱脅迫誘導(dǎo)，而且過表達(dá)該基因的擬南芥株系具有對(duì)ABA敏感性下降和對(duì)NaCl脅迫抗性增強(qiáng)的表型。推測ZmbZIP81基因編碼的蛋白可能作為ABA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子參與植物逆境脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控。 References 1 Fujita Y, Fujita M, Satoh R, Maruyama K,

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