淺談結(jié)締組織生長因子在病理性瘢痕中的表達(dá)

1、淺談結(jié)締組織生長因子在病理性瘢痕中的表達(dá)摘要： 目的 探討結(jié)締組織生長因子（CTGF在病理性瘢痕形成中的作 用。方法 采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（RT-PCR檢測10例瘢痕疙瘩（瘢 痕疙瘩組）和10例增生性瘢痕（增生性瘢痕組）中的 CTGF mRN的表達(dá)，并以 8例正常皮膚（正常皮膚組）作為對照。結(jié)果病理性瘢痕中CTGF mRN表達(dá)均明顯高于正常皮膚組（P關(guān)鍵詞：瘢痕疙瘩；增生性瘢痕；結(jié)締組織生長因子瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是臨床常見的病理性瘢痕，也是整形外科較難解 決的臨床問題，目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，病理性瘢痕是以成纖維細(xì) 胞為主的細(xì)胞成分過度增生以及以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度

2、沉積構(gòu)成，當(dāng)前普遍認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長因子-P 1 （TGF-P 1）是促進(jìn)纖維化的重要生長因子之一，在瘢 痕的形成過程中起著核心的作用1，而結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF） 是一種由成纖維細(xì)胞在 TGF-B 1刺激下產(chǎn)生的生長因子， 具有強(qiáng)烈的刺激成纖維細(xì)胞增殖和促進(jìn)膠原沉積的作用，作為TGF-P 1的重要下 游介質(zhì)2,在各種纖維化疾病中發(fā)揮著重要作用。我們應(yīng)用RT-PCF技術(shù)在核酸水平檢測CTGF在病理性瘢痕中的表達(dá)情況，探討CTGF在瘢痕中的作用，為探 求病理性瘢痕的成因?qū)で笠欢ǖ膶?shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法標(biāo)本來源和分組實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均來源于徐

3、州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科，所有標(biāo)本選取前均未進(jìn) 行過任何放療、藥物注射、外用藥物治療。患者均無系統(tǒng)性疾病，瘢痕表面無破 潰、感染。分組：瘢痕疙瘩組10例，年齡842歲，平均歲。病變部位包括 胸前、上臂、耳垂、上背部。增生性瘢痕組10例，年齡336歲，平均歲。病變部位包括前胸、下腹、頸部、四肢。正常皮膚組8例，年齡650歲，平均歲。為其他整形手術(shù)切除的正常皮膚標(biāo)本。標(biāo)本采集切取標(biāo)本時(shí)均在無菌條件下進(jìn)行，去除皮下脂肪組織及表皮，放入事先標(biāo) 記好序號的凍融管，立即投入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-70C冰箱保存?zhèn)溆?。試劑與設(shè)備TRNzol試劑（北京天根公司）;RNAPCR試劑盒（杭州博日科技有限公司）; 電

4、動(dòng)勻漿器（美國Homogehizer公司）;Eppendorf-5840R 臺式冷凍離心機(jī)（德國 Eppendorf公司）；PCR擴(kuò)增儀PTC-100（美國MJResearch公司）；電腦三恒多用 電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)INGENIUS （美國基因有限公司）。實(shí)驗(yàn)方法引物準(zhǔn)備參照人CTGF cDNZ序列，進(jìn)行特異性CTGF引 I物設(shè)計(jì)，同時(shí)選取P -actin 作為內(nèi)參照。CTGF序列：上游 5' -AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT 33-, 下游 5' -TCA TGC CAT GTC TCC GTA CAT CTT C-,擴(kuò)增片

5、段長度為 475 bp , P -actin :上游 5' -CCGCGAGAAGATGACCCAGAT-S，下游 5' -GAAGCATTT GCG GTG GAC GA-用這對引物可擴(kuò)增 P -actin cDNA 片段長度為781 bp。引 物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。組織總RNA提取取標(biāo)本組織50 mg剪碎后加入1 ml TRNzol試劑，電動(dòng)組織勻漿器勻漿，其后操作步驟按照試劑說明書進(jìn)行。抽提的總RNAM D260 nm和D280nm，并計(jì)算比值為，余下RNA加入30100卩I不含RNA酶的雙蒸水,70E冰箱保 存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄（RT反應(yīng)總體積10卩I，

6、RNA模板1卩I （2 卩g）, RNA酶抑制劑 卩I，5X RT Buffer 2 卩I ,10 mmol/L dNTP 1 卩I ,隨機(jī)引物 卩I，逆轉(zhuǎn)錄酶 卩I，不含 RNA酶的雙蒸水 卩I。按以下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：室溫10 min，45E 45 min， 95E 5 min，4C 5 min。cDNA 20C保存或直接擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增按以下條件配制反應(yīng)液：10X PCR Buffer 卩I, 10 mmoI/L dNTP 混合物 卩I, 5 卩moI/L CTGF上游及下游特異性引物各 卩I,Tap mix DNA聚合酶 卩I， RT產(chǎn)物卩I,加不含RNA酶的雙蒸水18卩I至總體積2

7、5卩I。按以下條件進(jìn)行 PCR反應(yīng)：94E預(yù)變性 3 min,然后 94E 30 s,65 E 30 s,72 E 7 min, 72E 5 min, 循環(huán)30次，末次延伸72E 5 min。結(jié)果分析取10卩I PCF產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓8 V/cm）,溴化乙啶（EB 染色，以P -actin為內(nèi)參照，設(shè)定值為1,經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析其灰度值 并計(jì)算比值。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用 單因素方差分析，采用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，PV為差異有顯著性。2 結(jié)果PCR產(chǎn)物結(jié)果可見到位于781 bp和475電泳結(jié)果見圖1。）的比較3組

8、PCF擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并在紫外燈下觀察， bp處各有1條特異性條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段長度相符。各組間CTGF mRN表達(dá)量（相對于 p -actin瘢痕疙瘩組與增生性瘢痕組 CTGFnRN表達(dá)量均明顯高于正常皮膚組（P）， 而瘢痕疙瘩組表達(dá)量又高于增生性瘢痕組 （P）。見表1。表13組間CTGFmRNA表達(dá)量的比較（略）3討論CTGF是 1991年Bradham等3用親和色譜法在人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)的，是一種富含半胱氨酸的多肽。在其他種屬的動(dòng)物如豬、 牛、蛙等體內(nèi)亦存在，在人體多種組織器官如心、肝、腎、動(dòng)脈和腦中廣泛存在。 內(nèi)皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及某些腫瘤

9、細(xì)胞均可表達(dá)CTGF4。根據(jù)靶細(xì)胞的不同，CTGF可以發(fā)揮不同的作用：促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成5;促進(jìn)血管的形成6;促進(jìn)細(xì)胞凋亡7;刺激成纖維細(xì)胞生長8。病理性瘢痕中CTGF高表達(dá)的意義人體皮膚成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的 CTGF表達(dá)潛能，正常狀態(tài)下不表達(dá)或表達(dá) 極少。CTGF乍為TGF-P 1的下游反應(yīng)介質(zhì)， 當(dāng)應(yīng)用TGF-B 1刺激后，CTGF表達(dá) 明顯上調(diào)，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞釋放的CTGF可以在TGF-B 1刺激下表達(dá)增加150倍9。Igarashi等10和劉劍毅等11研究均發(fā)現(xiàn) 瘢痕疙瘩中有廣泛分布的CTGF，瘢痕的增生程度越明顯，CTGF勺表達(dá)程度越高。 本研究結(jié)果顯示，普通瘢痕

10、纖維組織中 CTGF含量低于瘢痕疙瘩，而正常皮膚中 CTGF表達(dá)很少或不表達(dá)。由此可推測，病理性瘢痕形成過程中CTGF在 TGF-P 1的作用下高水平表達(dá)，進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì)，刺激組織成纖維細(xì)胞增殖和以膠原為 主的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，而增殖的成纖維細(xì)胞繼續(xù)分泌CTGF從而促進(jìn)瘢痕組織的不斷增生。這一點(diǎn)也解釋了臨床上瘢痕疙瘩為什么可以持續(xù)生長，并能不斷向周圍正常組織擴(kuò)展，同時(shí)也為從核酸和蛋白質(zhì)水平治療瘢痕提供了依據(jù)。CTGF在病理性瘢痕治療中的展望增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因、發(fā)病機(jī)制到目前為止尚不清楚。以往的實(shí) 驗(yàn)研究表明，在各種纖維化的疾病中 TGF-B和CTGF都同步增高。TGF-B 直 以來被

11、認(rèn)為是促進(jìn)纖維化的重要生長因子，但是由于TGF- P生物學(xué)效應(yīng)的多樣 化，作用的靶細(xì)胞種類較多，除可促進(jìn)纖維化外，尚參與機(jī)體的抗炎、調(diào)控細(xì)胞 分化、調(diào)節(jié)免疫等，如果阻斷TGF- P的表達(dá)，將可能引起細(xì)胞生長失控、免疫失調(diào)、嚴(yán)重炎癥等不良反應(yīng)12。本研究結(jié)果表明，CTGF乍為TGF- p的下游 反應(yīng)介質(zhì)，在病理性瘢痕的形成中起到一個(gè)重要的促纖維化作用。相比之下，CTGF的作用較為單一，主要作用于成纖維細(xì)胞而不影響上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞13。如果可以單純阻斷CTGF的表達(dá)或抑制其生物活性，既可以減輕 TGF-p的促纖 維化作用，又可以保留TGF-p有利的抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫作用，這將可能 成為一種安

12、全、高效且特異性強(qiáng)的抑制纖維化的方法，在將來的瘢痕防治中將會 發(fā)揮令人矚目的作用。目前針對 CTGF為靶點(diǎn)治療病理性瘢痕尚未見報(bào)道，如何 阻斷CTGF的表達(dá)或抑制其生物活性，有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Border WA,Noble NA. Transforming growth factor beta in tissue fibrosis J . N Engl J Med, 1994, 331 (19): 1286-1292.2 Fan WH,Kar no vsky MJ. In creased MMP-£xp ressi on in conn ectivetissue gr

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