田基黃不同提取物含藥血清體外抗乙肝和抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、田基黃不同提取物含藥血清體外抗乙肝和抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究(一)    作者：潘小姣 楊柯 曾金強(qiáng) 韋志英 陳晨【摘要】 目的觀察田基黃不同提取物的含藥血清體外抗乙肝和抗肝癌的作用。方法采用酶鏈免疫法，觀察田基黃不同提取物的含藥血清對2215細(xì)胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用。采用MTT技術(shù)，觀察田基黃不同提取物的含藥血清對肝癌細(xì)胞BEL-7404增殖的抑制作用。結(jié)果當(dāng)含藥血清濃度為5時(shí)，田基黃乙醇總提取物和正丁醇提取物對HBeAg和HBsAg呈現(xiàn)較好抑制作用，抑制率分別為34.84和57.95，以及76.02和53.15（P0.05）；當(dāng)含藥血清濃

2、度為20時(shí)，醋酸乙酯提取物對HBeAg和HBsAg呈現(xiàn)較好的抑制作用，抑制率分別為79.79和57.22（P0.05）；水提取物3種濃度的含藥血清對HBeAg和HBsAg都有較好的抑制作用，抑制率分別達(dá)到了70和30以上（P0.05）。田基黃各提取物對肝癌BEL-7404細(xì)胞都有一定的抑制作用，該抑制作用呈明顯的量效關(guān)系，當(dāng)含藥血清濃度為20時(shí)，乙醇總提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的抑制率分別為29.74，53.80，40.79和54.24（P0.01）。結(jié)論 田基黃不同提取物含藥血清能抑制2215細(xì)胞分泌HBeAg和HBsAg，并且能抑制肝癌細(xì)胞BEL-7404的增殖。其抗乙

3、肝的有效成分主要分布在田基黃的水提取物中，而抗肝癌的有效成分則均衡分布于各種極性部位。 【關(guān)鍵詞】 田基黃 2215細(xì)胞 BEL-7404細(xì)胞 血清藥理學(xué)Abstract：ObjectiveTo observe the anti- hepatitis B and anti-hepatoma effect of different extracts in serums of Hypericum japonicum Thunb. in vitro. MethodsEnzyme linked immune response was used to investigate the effect of

4、the different extracts in serums of Hypericum japonicum Thunb. on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cell in vitro.MTT technique was used to investigate the effect of the different extracts in serums of Hypericum japonicum Thunb. on the growth of hepatoma BEL-7404 cell in vitro. ResultsEtOH and BuOH e

5、xtracts showed better inhibitory rates on HBeAg and HBsAg as 34.84，57.95 and 76.02，53.15（P0.05）in 5% serum respectively. EtOAc extracts showed better inhibitory rates on HBeAg and HBsAg as 79.79 and 57.22（P0.05）in 20% serum respectively. H2O extracts had stable inhibitory rates on HBeAg and HBsAg in

6、 the three different concentration of serum and the inhibitory rates were all more than 70% and 30% respectively. All extracts showed the inhibitory activity on the growth of hepatoma BEL-7404 cell in vitro and there was obvious dose-effect relationship. The inhibitory rates of EtOH，EtOAc，BuOH and H

7、2O extracts in 20% serum were 29.74，53.80，40.79 and 54.24,respectively(P0.01).ConclusionThe different extracts of Hypericum japonicum Thunb. in serum have the inhibitory effect on HBeAg and HBsAg excreted by 2215 cell and on the growth of hepatoma BEL-7404 cell in vitro. The stable active compounds

8、of anti- Hepatitis B mainly distribute in H2O extracts and the active compounds of anti-hepatoma evenly distribute in each extracts.Key words：Hypericum japonicum Thumb.; 2215 Cell; BEL-7404 Cell; Seropharmacology田基黃原名地耳草，始載于生草藥性備要植物名實(shí)圖考，別名雀舌草，系藤黃科金絲桃屬植物地耳草Hypericum japonicum Thumb.的干燥全草。味甘、微苦，性涼，歸肝、

9、膽、大腸經(jīng)。具有清熱利濕、散瘀止痛、消腫解毒的功效1?，F(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)田基黃中含有內(nèi)酯、香豆素、酚類、蒽醌、黃酮類、維生素類等化學(xué)成分14?，F(xiàn)代藥理研究表明，田基黃具有明確的保肝、抑制癌細(xì)胞藥理學(xué)功效；臨床用于治療急、慢性肝炎，傳染性肝炎，原發(fā)性肝癌，傷寒，副傷寒等。但是直至目前，田基黃的抗乙肝和肝癌有效成分或有效部位仍然不夠清晰。本實(shí)驗(yàn)研究旨在闡明田基黃的抗乙肝和肝癌有效部位，為進(jìn)一步確定其有效化學(xué)成分奠定基礎(chǔ)。1 材料 1.1 藥物 田基黃經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院藥用植物教研室韋松基副教授鑒定為藤黃科金絲桃屬植物地耳草Hypericum japonicum Thumb.的干燥全草。1.2 動(dòng)物 昆明種小

10、鼠，體重2226 g，雌雄兼用，由廣西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：桂醫(yī)動(dòng)字第11004號(hào)。1.3 試劑 Eagles MEM干粉、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司產(chǎn)品，批號(hào)：1041001，批號(hào)：1243098）；G418、L-谷氨酰胺（北科化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝）；新生牛血清(NBS，杭州四季青公司，批號(hào)：060720)；卡那霉素、青霉素、鏈霉素（Sigma分裝）；二甲基亞砜（DMSO，上海生物工程有限公司，批號(hào)：54186）；HBsAg，HBeAg檢測試劑盒（上海榮盛生物科技有限公司，批號(hào)：20070605，20070711）；MTT (北京拜爾迪生物公司分裝，Amres

11、co0793)。1.4 細(xì)胞系及培養(yǎng)液 HBV-DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞的2215細(xì)胞（購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國醫(yī)藥生物技術(shù)研究所）： 2215細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液含10%胎牛血清，0.03%谷氨酰胺，G418 380g·ml-1，卡那霉素50 U·ml-1，pH7.2。細(xì)胞消化液含0.25%胰蛋白酶，用D-Hangs配制。肝癌BEL-7404細(xì)胞(廣西民族醫(yī)院惠贈(zèng))：肝癌BEL-7404細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液含10%胎牛血清、青霉素100 U·ml-1，鏈霉素100 U·ml-1。細(xì)胞消化液含0.25%胰蛋白酶，用D-Han

12、gs配制。1.5 器材 培養(yǎng)瓶（丹麥Tunclon公司產(chǎn)品）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司產(chǎn)品）；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Forma公司)；倒置顯微鏡(德國Leica公司)；酶標(biāo)儀(奧地利Sunrise公司)；吉爾森微量移液器(法國Pipetman公司)；BDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。2 方法與結(jié)果2.1 田基黃不同提取物的制備 取田基黃95乙醇提取干浸膏37.6 g（每克干浸膏相當(dāng)于9.1 g生藥），溶于300 ml水中，用醋酸乙酯萃取5次，300 ml/次；水層再用正丁醇萃取5次，300 ml/次。分別合并水層，正丁醇層和醋酸乙酯層，減壓回收溶

13、劑，備用。另取37.6 g田基黃干浸膏，和上述各層提取物，分別溶于適量水中，最后定容成100 ml，4保存?zhèn)溆谩?.2 含藥血清的制備5 取小鼠40只, 體重2226 g，雌雄兼用。分為5組：空白血清組(灌胃給予生理鹽水)，田基黃乙醇總提取物血清組，田基黃醋酸乙酯提取物血清組，田基黃正丁醇提取物血清組，田基黃水提取物血清組。含藥血清組按每次20 ml·kg -1（68.4 g生藥/kg）劑量灌胃給藥，每天給藥兩次（每天的總給藥量約為田基黃半數(shù)致死量的50%），連續(xù)3 d，末次給藥后1 h，摘眼球取血，離心分離血清，56滅活30 min。分別用不含血清的MEM培養(yǎng)液和RPMI-1640

14、培養(yǎng)液稀釋成40%，20和10的血清濃度，分別過濾，4保存?zhèn)溆谩?.3 細(xì)胞培養(yǎng)2.3.1 2215細(xì)胞培養(yǎng)在長滿2215細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)用0.25%胰酶，37消化34 min，加培養(yǎng)液吹散，13傳代；10 d長滿。消化后計(jì)數(shù)，配制成1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100l，在37，5的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長成單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將含各濃度血清的MEM培養(yǎng)液加入到96孔板中，每種血清每濃度平行3孔，每孔100l，使含藥血清最終濃度分別為20、10和5。同時(shí)設(shè)無藥物細(xì)胞對照組和培養(yǎng)液空白對照組各3孔。收集第4天細(xì)胞培養(yǎng)上清液，在450 nm波長處用酶標(biāo)儀測OD

15、值。應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間檢驗(yàn)，并按以下公式計(jì)算抑制率。結(jié)果見表1。抑制百分率(%)無血清細(xì)胞對照組OD值均數(shù)田基黃提取物血清組OD值均數(shù)無血清細(xì)胞對照組OD值均數(shù)培養(yǎng)液空白對照組OD值均數(shù)×1002.3.2 肝癌BEL-7404細(xì)胞的培養(yǎng)將培養(yǎng)瓶中的7404細(xì)胞株用0.25%胰蛋白酶、0.2% EDTA消化后，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，將細(xì)胞配制成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100l，置于37，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長后(約15 h)，每孔分別加入含不同濃度血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，每種血清每濃度平行6孔，

16、每孔100l，使含藥血清最終濃度分別為20，10和5。每個(gè)96孔培養(yǎng)板中設(shè)無血清細(xì)胞對照組各6孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后加入0.5MTT溶液，10l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。2000 r·min-1離心15 min，棄去上清液；每孔加入200l DMSO，輕振10 min后在490 nm波長處用酶標(biāo)儀測OD值。應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間檢驗(yàn)，并按以下公式計(jì)算抑制率。結(jié)果見表2。抑制率（%）空白血清組OD值均數(shù)田基黃提取物血清組OD值均數(shù)空白血清組OD值均數(shù)×100%對2215細(xì)胞分泌HBeAg和HBsAg的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)含藥血清濃度為5時(shí)，田基黃乙醇總提取物和正丁

17、醇提取物對HBeAg和HBsAg呈現(xiàn)較好抑制作用，抑制率分別為34.84和57.95，以及76.02和53.15（P0.05）；當(dāng)含藥血清濃度為20時(shí)，醋酸乙酯提取物對HBeAg和HBsAg呈現(xiàn)較好的抑制作用，抑制率分別為79.79和57.22（P0.05）；水提取物3種濃度的含藥血清對HBeAg和HBsAg都有較好的抑制作用，抑制率分別達(dá)到了70和30以上（P0.05）。提示田基黃中的水溶性化學(xué)成分對HBeAg和HBsAg存在較穩(wěn)定的抑制作用，并且沒有明顯的量效關(guān)系；同時(shí)各極性部位單獨(dú)用藥對HBeAg的抑制效果明顯優(yōu)于混合用藥的抑制效果。對肝癌BEL-7404細(xì)胞的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：田基黃不

18、同提取物對肝癌BEL-7404細(xì)胞都有較好的抑制作用，該抑制作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，當(dāng)含藥血清濃度為20時(shí)，乙醇總提取物、醋酸乙酯提取物、正丁醇提取物和水提取物的抑制率分別為29.74，53.80，40.79和54.24（P0.01）。提示田基黃抗肝癌的有效成分均衡分布于各種極性部位中，而且各極性部位單獨(dú)用藥的效果要優(yōu)于混合用藥的效果。表1 田基黃不同提取物的血清在2215細(xì)胞培養(yǎng)中對乙肝HBeAg和HBsAg的抑制作用（略）與細(xì)胞對照組比較，表示P0.01，表示P0.05，表示P0.05；n=3表2 田基黃不同提取物的血清對肝癌BEL-7404細(xì)胞的抑制作用（略）與空白血清組比較，P0.01，P0.05，P0.05；n=63 討論中藥血清藥理學(xué)是指在動(dòng)物經(jīng)口服給藥后一定時(shí)間采血分離血清，用此含藥血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種實(shí)驗(yàn)方法6。這種新的實(shí)驗(yàn)方法可排除在體外實(shí)驗(yàn)中各種干擾因素的影響，比較接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程。作者利用血清藥理學(xué)方法，研究田基黃不同提取物在體外對2215細(xì)胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用和對肝癌BEL-7404細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果表明田基黃