突變型人胰島素原基因的克隆及其腺病毒載體的構(gòu)建

1、突變型人胰島素原基因的克隆及其腺病毒載體的構(gòu)建         【摘要】  目的: 構(gòu)建含有定點(diǎn)突變的人胰島素原基因的腺病毒表達(dá)載體。方法: 首先利用RTPCR 方法從正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織獲取野生型人胰島素原cDNA; 然后通過重疊延伸PCR方法在人胰島素原cDNA 上產(chǎn)生2個(gè)突變位點(diǎn), 使突變的cDNA編碼的蛋白質(zhì)含弗林蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn), 該突變型胰島素原cDNA片段命名為INSM2; 最后將INSM2亞克隆至腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體的多克隆位點(diǎn)上, 并與骨架載體共轉(zhuǎn)染至細(xì)菌內(nèi), 通過細(xì)菌內(nèi)同源重組得到

2、重組載體。結(jié)果: Hind 和Xho I 酶切、 Pac I酶切及測(cè)序均證實(shí)載體pAdINSM2構(gòu)建成功。結(jié)論: 構(gòu)建的含定點(diǎn)突變?nèi)艘葝u素原基因腺病毒載體pAdINSM2為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染非胰島細(xì)胞, 對(duì)糖尿病進(jìn)行基因治療奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】  胰島素原 腺病毒載體/pAdEasy1 弗林蛋白酶糖尿病已成為僅次于心腦血管病癥和癌癥的第三大致死疾病, 胰島素是治療糖尿病的主要藥物, 但由于隨時(shí)需要注射胰島素,  給患者帶來了極大的不便, 對(duì)糖尿病的基因治療成為了可能。隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域取得的迅猛發(fā)展, 特別是重組DNA 技術(shù)的建立1, 我們通過重疊延伸PCR技術(shù)對(duì)胰島素原基因進(jìn)

3、行2個(gè)位點(diǎn)的突變, 將人胰島素原基因cDNA 上BC鏈連接處的堿基序列Lys Thr Arg Arg 及CA鏈連接處的Leu Gln Lys Arg分別突變?yōu)锳rg Thr Lys Arg及Arg Gln Lys Arg序列, 以使其可以被弗林蛋白酶識(shí)別2。然后將突變型的人胰島素原基因構(gòu)建到腺病毒載體中, 使其有望成為糖尿病基因治療理想的候選載體之一, 并為進(jìn)一步進(jìn)行人胰島素原基因轉(zhuǎn)染非胰島細(xì)胞, 使之產(chǎn)生胰島素治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。1  材料和方法11  材料 PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、 限制性內(nèi)切酶Hind 、  Xho I、  Probest

4、 DNA聚合酶、 Simple T Vector、 DNA marker均購于大連寶生物公司;  T4 DNA 連接酶、 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購于Invitrogen公司;  限制性內(nèi)切酶Pme I、 Pac I購于NEB公司;  質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒購于賽百盛;  引物由上海生物工程有限公司合成;   pAdEasy1載體系統(tǒng)、 DH5菌株、 BJ5183菌均由血研所中法實(shí)驗(yàn)室保存。12  方法121  引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank發(fā)表的人胰島素原基因cDNA序列, 綜合利用Primer5和Oligo6引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)

5、計(jì)人胰島素原基因全長(zhǎng)的引物, INS1: 5GCT  CTC GAG  GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT3;  INS2: 5GAG  AAG CTT  GCT GCG TCT AGT TGC AGT AGT3, 劃線部分為酶切位點(diǎn)（Xho I 和Hind III）。再根據(jù)PCR定點(diǎn)突變?cè)? 分別在人胰島素原基因BC鏈及CA鏈連接處進(jìn)行2次突變, 突變引物設(shè)計(jì)如下:  INS3: 5TTC TTC TAC ACA CCC CGG ACC CGC3;  INS4: 5GCG GGT CCG GGG TGT

6、 GTA GAA GAA3;  INS5: 5GTC CCG GCA GAA GCG TGG CAT TGT3;  INS6: 5ACA ATG CCA CGC TTC TGC CGG GAC3;  斜粗體劃線部分為突變的位點(diǎn)。122  野生型人胰島素原基因的獲得 取胎齡5個(gè)月的經(jīng)水囊引產(chǎn)的健康胎兒胰腺組織, 液氮中冷凍過后用DEPC處理過的研缽研磨, 然后加入TRIzol抽提總RNA, 以提取的總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后合成的cDNA為模板, 以引物INS1和INS2進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件: 94, 預(yù)變性5 min;  變性、退火及延伸

7、條件分別是94 30 s, 60 30 s, 72 30 s, 共進(jìn)行30次循環(huán);  最后72延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR 產(chǎn)物克隆至T載體上進(jìn)行篩選、 擴(kuò)增及鑒定, 并送測(cè)序公司測(cè)序。         123  突變型人胰島素原基因的獲得 采用重疊延伸PCR 法, 使人胰島素原基因產(chǎn)生兩處突變。以獲得的野生型人胰島素原基因?yàn)槟０? 首先進(jìn)行B鏈/C肽連接處的突變。用引物INS1、 INS4和引物INS3、 INS2分別擴(kuò)增出兩段PCR產(chǎn)物,

8、利用引物INS3和INS4的互補(bǔ)部分使這兩段PCR產(chǎn)物互為模板和引物, 在DNA聚合酶的作用下延伸出整條人胰島素原基因, 然后再加入引物INS1和INS2繼續(xù)擴(kuò)增含有第一個(gè)突變的人胰島素原基因（命名為INSM1）, 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體中, 并送測(cè)序公司測(cè)序鑒定。第二處突變?cè)贑肽與A鏈的連接處。以經(jīng)測(cè)序第一處突變改造成功的人胰島素原基因?yàn)槟０? 用引物INS1、 INS6和引物INS5、 INS2經(jīng)過以上同樣的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生含有第二個(gè)突變的人胰島素原基因（命名為INSM2）, 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T載體中送測(cè)序公司測(cè)序鑒定。124  穿梭腺病毒載體的構(gòu)建 將腺病毒穿梭質(zhì)粒pAd

9、trackCMV和突變型人胰島素原基因（INSM2）分別用Hind 和Xho雙酶切, 純化、 回收雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接, 連接反應(yīng)條件為INSM2雙酶切產(chǎn)物5 L、  pAdtrackCMV雙酶切產(chǎn)物3 L、  Buffer  1 L、  T4 DNA連接酶1 L,  16  16  h, 連接產(chǎn)物命名為pAdtrackINSM2, 轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞, 鋪板、  挑菌、 搖菌、 提取質(zhì)粒,  Hind 、 Xho酶切鑒定。125  重組腺病毒載體的構(gòu)建 先把BJ5183細(xì)菌用氯化鈣法

10、制備成感受態(tài), 將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1轉(zhuǎn)化到BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中, 鋪板、 挑菌、 搖菌后再用同樣的方法制備成感受態(tài)細(xì)胞。然后pAdtrackINSM2被限制性內(nèi)切酶Pme線性化, 再經(jīng)堿性磷酸酶CIAP處理后, 轉(zhuǎn)化入含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中去同源重組。經(jīng)過鋪板、 挑菌、 搖菌、 提取質(zhì)粒等步驟獲得重組質(zhì)粒pAdINSM2。經(jīng)Hind 、  Xho和Pac酶切鑒定。2  結(jié)果21  野生型人胰島素原基因的擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的人INS的特異性引物, 以正常流產(chǎn)胎兒胰腺組織總RNA為模板, 采用RTPCR的方法, 擴(kuò)增出人

11、INS全長(zhǎng)的cDNA片段, 片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。22  人胰島素原基因的定點(diǎn)突變  采用重疊延伸PCR 法, 以獲得的野生型人胰島素原基因?yàn)槟０? 用引物INS1、 INS2、 INS3、 INS4擴(kuò)增得到2個(gè)PCR產(chǎn)物（PCR1和PCR2）, 將兩段PCR產(chǎn)物連接, 使其在B鏈/C肽連接處產(chǎn)生2個(gè)堿基的突變, 得到INSM1（圖2）。將其連接到T載體上并轉(zhuǎn)化到DH5中, 經(jīng)測(cè)序鑒定位點(diǎn)突變成功。再以INSM1為模板, 用引物INS1、 INS2、 INS5、 INS6擴(kuò)增得到另兩段PCR產(chǎn)物（PCR3和PCR4）,同樣將兩段PCR產(chǎn)物連接, 使其又在C肽/A鏈

12、連接處產(chǎn)生一個(gè)堿基的突變, 得到INSM2（圖2）。將其連接到T載體上并轉(zhuǎn)化到DH5中, 經(jīng)測(cè)序鑒定位點(diǎn)突變成功。23  穿梭腺病毒載體的構(gòu)建 膠回收Hind /Xho雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdtrackCMV和含突變型人胰島素原基因的T載體（INSM2T）, 連接后產(chǎn)物命名為pAdtrackINSM2, 轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞后提取質(zhì)粒, 經(jīng)Hind 、  Xho酶切鑒定與預(yù)期結(jié)果一致（圖3）。24  重組腺病毒載體的構(gòu)建 通過氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pAdEasy1轉(zhuǎn)化于BJ 5183菌后, 抽提質(zhì)粒后電泳鑒定, 與原來的pAdEasy1質(zhì)粒

13、大小一致。pAdtrackINSM2質(zhì)粒線性化后也通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化于含pAdEasy1的BJ 5183感受態(tài)細(xì)胞, 小量抽提質(zhì)粒, 經(jīng)PCR及Pac I酶切的方法鑒定為含有INSM2基因的陽性克隆。其中, 經(jīng)Pac I酶切產(chǎn)生一個(gè)大約35 000 bp的大片段和一個(gè)約4 500 bp的小片段,  經(jīng)PCR可檢測(cè)到約400 bp左右的INSM2基因的插入（圖4）。3  討論   胰島素作為糖尿病的特效藥用于臨床已有70多年的歷史。但從目前看來多次注射胰島素、 胰腺移植、 胰島細(xì)胞移植等都存在各種弊端3, 4,  隨著基因重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展

14、, 使基因治療糖尿病成為可能5。研究發(fā)現(xiàn)6, 只有胰島細(xì)胞含有特定前激素轉(zhuǎn)化酶(PC2和PC3), 可以把人胰島素原合成為成熟的具有生理活性的胰島素A鏈和B鏈復(fù)合體。而非細(xì)胞不含這類酶, 但在大多數(shù)非細(xì)胞內(nèi)普遍表達(dá)furin蛋白酶, 它的底物是Arg Thr Lys Arg 或Arg Gln Lys Arg。所以我們將人胰島素原基因cDNA 上BC 鏈連接處的堿基序列Lys Thr Arg Arg 及CA 鏈連接處的Leu Gln Lys Arg 分別突變?yōu)锳rg Thr Lys Arg 及Arg Gln Lys Arg 序列, 使其成為furin蛋白酶的底物, 從而使非細(xì)胞在轉(zhuǎn)染突變后的人胰

15、島素原基因后, 能夠合成成熟胰島素并分泌到細(xì)胞外, 發(fā)揮生理功能。   在基因治療研究中, 病毒載體是比較常用的載體。在眾多的病毒載體中, 腺病毒因其: (1)既可以感染分裂期, 又可以感染非分裂期細(xì)胞;  (2)外源基因表達(dá)水平高;  (3)病毒滴度高, 制備純化相對(duì)容易;  (4)插入外源基因容量大;  (5)病毒基因組較少發(fā)生重排等五大優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注。特別是一些人腺病毒和動(dòng)物腺病毒載體的構(gòu)建成功及其在臨床上的成功應(yīng)用,  使得腺病毒作為載體的研究受到普遍的重視7, 8。我們的實(shí)驗(yàn)選取了pAdEasy1腺病毒載體系統(tǒng), 首先將我們的目的基因連接到它的穿梭載體中, 經(jīng)過線性化之后, 用堿性磷酸酶（CIAP）處理線性化的穿梭載體, 然后再去與骨架載體重組, 最終成功構(gòu)建了腺病毒載體。我們的實(shí)驗(yàn)構(gòu)建含有定點(diǎn)突變的人胰島素原基因的腺病毒表達(dá)載體, 為進(jìn)一步進(jìn)行胰島素基因轉(zhuǎn)染非胰島細(xì)胞, 使之產(chǎn)生胰島素治療糖尿病奠定基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】  1袁鳳山