蛋白酶的鹽析沉淀實驗報告

1、蛋白酶的鹽析沉淀實驗報告班級：生工1005 學(xué)號：0203100520姓名：朱同輝實驗?zāi)康模?. 掌握使蛋白質(zhì)膠體溶液保持穩(wěn)定的因素；2. 了解蛋白質(zhì)沉淀的幾種方法及其意義；3. 掌握測定蛋白酶活力的原理和方法；4. 學(xué)習(xí)酶活力的計算方法。實驗原理：鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)溶解度增加，稱為鹽溶；而加入大量中性鹽達(dá) 一定濃度，蛋白質(zhì)就會沉淀，稱為鹽析。原理：大量鹽加入后，能與蛋白質(zhì)爭奪水分子，去除水膜；大量鹽能中和蛋白質(zhì)分子表面電荷，使分子間靜電斥力減弱，疏水作用增強(qiáng)，使蛋白 質(zhì)沉淀。鹽析效果：二價離子 > 一價離子離子半徑小 > 離子半徑大陽離子：Mg2+>

2、Ca2+>Ba2+>NH4+>Na+>K+>Pb+>Cs+陰離子：PO43->SO42->Cl->Br->NO3->I->SCN-蛋白質(zhì)的溶解度與鹽離子強(qiáng)度間的關(guān)系可以用Cohn經(jīng)驗式來表示：log S 二 -K sI式中：s蛋白質(zhì)的溶解度I離子強(qiáng)度B 常數(shù)，與溫度和pH有關(guān)22c i z i鹽濃度Ks 鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān) 其中I根據(jù)下式計算：式中：cii離子的濃度（mol/L） zii離子所帶的電荷蛋白酶活力的測定福林（Folin）試劑在堿性條件下可被酪氨酸還原成蘭色化合物，蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生 酪氨酸，將

3、產(chǎn)物中未被水解的酪蛋白除去后與福林試劑作用，根據(jù)顯蘭色的深淺可以計算出 酪氨酸的產(chǎn)生量，從而推斷酶活力的大小。酶活力410K N O .D 680蛋白酶液的稀釋、酶活測定和計算K 在酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上 O.D值為l時酪氨酸的微克數(shù)（卩g），K值為108.53N酶液稀釋倍數(shù)4酶反應(yīng)液為4 ml，取出1 ml測定，故乘以410反應(yīng)時間為10 min參考稀釋倍數(shù)：原酶、飽和度20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%的上清液分別為 1000, 200, 150, 100, 100, 100, 50 倍實驗步驟：1）蛋白質(zhì)鹽析分兩個大組進(jìn)行實驗， 每大組取6只燒杯編號，分別加入50 ml蛋

4、白酶液，分別稱量5.70,8.80, 12.16 , 15.66, 19.5和23.6固體硫酸銨粉末（對應(yīng) 20% , 30%, 40% , 50%, 60% , 70%飽和度），在磁力攪拌器不 斷攪拌下，將其緩慢加入酶液中，加完后再攪拌5 min，使硫酸銨完全溶解。然后靜置使蛋白酶沉淀完全。將含有沉淀的酶液小心倒入離心管中，在天平上稱重平衡，用高速冷凍離心機(jī)離心于10C, 10,000 r/min離心20 min。將上層清液倒入量筒記錄其體積，并分別測定酶活（u/ml）,即為該酶的溶解度 S。2）蛋白酶活力的測定：1將2%酪蛋白溶液40C預(yù)熱3-5min2.取3支試管編號0、1、2，分別吸取

5、待測酶液 1ml放入試管中，40C水浴中預(yù)熱1-2min3往0號試管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支試管中加入2%酪蛋白1ml，計時搖勻，40C反應(yīng) 10mi n4往1、2號試管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，搖勻，取出3支試管靜置10min5. 另取3支試管，分別吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5ml，福林試劑1ml，于40 C水浴中保溫20min顯色。6. 以0號管為對照，在波長 680nm處測定1、2號管的吸光度，求出平均值。3）蛋白酶液的稀釋、酶活測定和計算計算出各種硫酸銨飽和度下的硫酸銨濃度，離子強(qiáng)度，蛋白酶溶解度和上清液酶活殘留，并填表。以lo

6、g S為縱坐標(biāo)，I為橫坐標(biāo)作圖，將直線部分線性回歸，求出Ks和3的數(shù)值，建立起蛋白酶的鹽析曲線。數(shù)據(jù)記錄及實驗結(jié)果：編號OD680平均值上清液體積/mL原酶液10.3880.40620.424飽和度20%11.0691.12155.821.173飽和度30%10.8190.82155.420.823飽和度40%10.9520.98553.021.018飽和度50%10.0210.22056.220.418飽和度60%10.0620.05158.520.040飽和度70%10.0910.15162.120.211編號(NH4)2SO4 濃度 mol/L離子強(qiáng)度1上清液酶活蛋白酶溶解度SlogS原酶液00飽和度20%0.822.464866271522.85.43飽和度30%1.233.697128394891.25.59飽和度40%1.644.926414339942.05.53飽和度50%2.056.1595553671.04.72飽和度60%2.467.3822112928.54.11飽和度70%2.878.6132820368.84.31討論：通過本次試驗，初步掌握了蛋白酶鹽析沉淀及其酶活