mtt試驗(yàn)的諸多問(wèn)題分析

1、MTT試驗(yàn)中的諸多問(wèn)題細(xì)胞：1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。3. 時(shí)

2、間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。4.培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的45次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。5.MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。6.理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。7.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔

3、，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。8.避免血清干擾。用含15胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)步驟貼壁細(xì)胞：1.收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。2.5%CO2，37孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，

4、細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況3.5%CO2，37孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二

5、甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)⒀a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul ；加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；需檢測(cè)物10ul；細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100?(儲(chǔ)存液100 1640）。2）置37，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/

6、ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。MTT的配制MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4ºC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存

7、在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時(shí)用用PBS<ph=7.4>溶解,也有人用生理鹽水配，60水浴助溶。PBS配方:Nacl 8gKcl 0.2gNa2HPO4 1.44gKH2PO4 0.24g調(diào)

8、ph 7.4定容1L關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板)細(xì)胞過(guò)了30代以后就不要用了,因?yàn)闋顟B(tài)不好了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。接種時(shí)最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種, 因?yàn)榧?xì)胞密度在10000/ml左右時(shí)，所測(cè)得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié)果最可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會(huì)很明顯，太密細(xì)胞可能都會(huì)凋亡，因?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)的太快營(yíng)養(yǎng)會(huì)不夠，最后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過(guò)密或者過(guò)少，增殖都會(huì)過(guò)快或者過(guò)慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來(lái)定.如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有刺激作

9、用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對(duì)照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104.其它的聲音：1.首先細(xì)胞的接種密度一定不能過(guò)大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會(huì)很大。2.MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20的波動(dòng)也是常見(jiàn)的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過(guò)關(guān)。3.我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT

10、實(shí)驗(yàn),這種細(xì)胞長(zhǎng)的很快一開(kāi)始我是用100000/ML的濃度來(lái)接種的,結(jié)果細(xì)胞長(zhǎng)的太滿結(jié)果是沒(méi)有梯度也沒(méi)有線性關(guān)系.后來(lái)調(diào)整濃度,用過(guò)4000080000/ML的濃度都做過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是6000070000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細(xì)胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒(méi)有很好的線性關(guān)系.還有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及藥物的特性(有時(shí)間依賴(lài)性和濃度依賴(lài)性的藥物)來(lái)確定培養(yǎng)時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來(lái)，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多

11、，但是如果操作不熟，CV會(huì)在8%左右。另外，吹散次數(shù)過(guò)多也會(huì)影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。首先說(shuō)說(shuō)我的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：1.吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細(xì)胞懸液。2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過(guò)多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過(guò)少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益3.吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來(lái)一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開(kāi)液面，否則容易吹打出氣泡。4.吹打次數(shù)100

12、左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞前吹打3050次基本就差不多均勻了。加細(xì)胞的時(shí)候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細(xì)胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）5.向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時(shí)不要太快，否則你會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在加入的瞬間會(huì)由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì)產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以速度不能太快也不能太慢。我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復(fù)3下移動(dòng)，目的是使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞，最后細(xì)胞全死了，建議不要采用這

13、種方法混勻細(xì)胞。加入MTT個(gè)人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當(dāng)比例，具體細(xì)胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系確實(shí)不好確定，我認(rèn)為MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家報(bào)道不同，一般是過(guò)量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過(guò)100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養(yǎng)基混勻，不過(guò)這個(gè)應(yīng)該關(guān)系不大。如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細(xì)胞前還是需要以過(guò)濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的因?yàn)檠逯邪椎鞍讓?duì)大部分的藥

14、物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨(dú)將藥物和MTT加在一起，看會(huì)不會(huì)起反應(yīng)。如果不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。如何清除上清百家爭(zhēng)鳴：1.加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法,懸浮細(xì)胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。2.我每次將MTT加入后，再孵育四個(gè)小時(shí)，然后用離心機(jī)離心1000G,5min。但是用槍小心地吸上清，還是會(huì)將一小部分藍(lán)色結(jié)晶吸

15、出。所以還是建議翻轉(zhuǎn)倒扣的方法吧！3.另外，可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）23次，比用“吸”的辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來(lái)。可以輕拍，或者傾斜一點(diǎn)幫助吸液，發(fā)現(xiàn)紫色結(jié)晶幾乎沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的掉脫，但前提是你本身細(xì)胞貼壁要比較牢，半貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞容易脫離。假如藥物作用時(shí)間長(zhǎng)的話，陰性對(duì)照組可能由于細(xì)胞過(guò)多而使加入后形成的結(jié)晶漂起來(lái)，這樣就不能直接倒掉上清。4.做MTT時(shí)，這一步驟一定要小心，不要采用倒的方式。因?yàn)橘N壁不牢的細(xì)胞會(huì)被倒掉，從而影響OD值。懸浮細(xì)胞，不要翻板，離心后也不要翻板，這個(gè)方法害死人。5.加完MTT反應(yīng)34h后，從培養(yǎng)箱取出96孔板的動(dòng)作要輕柔，避免振蕩結(jié)晶,使其滑落.你可以試

16、著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸，有的細(xì)胞可以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個(gè)個(gè)用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每個(gè)孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板后就不要反復(fù)傾斜放平，這樣也會(huì)使結(jié)晶脫落。6.用醫(yī)用的注射器加上針頭吸取液體的，吸取時(shí)要把板子斜放，沿著壁吸取就好了！這次MTT我用1ml針頭仔細(xì)吸培養(yǎng)液,覺(jué)得比其它方法可靠,一般不會(huì)吸走紫色結(jié)晶.避免清除上清而改進(jìn)的方法由于一般可離心96孔板的離心機(jī)不好找。既使是貼壁細(xì)胞做MTT時(shí)，用DMSO溶解得到結(jié)果也不好，不是得不到預(yù)期結(jié)果就是可重復(fù)性差。解決方法1:用以下文獻(xiàn)方法：周建軍等，評(píng)價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國(guó)醫(yī)

17、藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457具體方法：配三聯(lián)溶解液：10%SDS，5%異丁醇，0.012mol/LHCL，蒸餾水溶解。三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml溶液操作：在培養(yǎng)板上加一定密度的細(xì)胞懸液，90ul孔；如需給藥，則再于同時(shí)(懸浮細(xì)胞)或4h后(貼壁細(xì)胞)加入不同濃度的藥物10ul孔，均設(shè)三復(fù)孔。另外，每塊板上另沒(méi)一個(gè)調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞和藥物)。培養(yǎng)2d后，加入MTT溶液20ul孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加入上述三聯(lián)液100ul孔，于37度放置過(guò)夜后，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔A570值。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化操作，提高了可靠性。

18、解決方法2：日本同仁有一種新試劑CCK-8試劑， CCK-8試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST8其化學(xué)名稱(chēng)為：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。CCK-8試劑中已預(yù)先配入了進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析所需的成分，無(wú)需再用緩沖液或培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋

19、；同時(shí)，CCK-8試劑無(wú)需任何放射性同位素和有機(jī)溶劑。因此，無(wú)需特別的技巧，就可使每一位使用者準(zhǔn)確、快速地得到重現(xiàn)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。優(yōu) 點(diǎn)1、簡(jiǎn) 便 只需一步即可得到結(jié)果2、省 時(shí) 毋需預(yù)制，即開(kāi)即用3、安 全 毋需放射性同位素和有機(jī)溶劑4、快 速 省去了溶解除沉操作5、靈敏度高 靈敏度高于MTT6、重現(xiàn)性好 步驟少；無(wú)損失；結(jié)果準(zhǔn)確就是比較貴，如果經(jīng)費(fèi)充足，用這個(gè)是不錯(cuò)的。進(jìn)行細(xì)胞增殖分析的使用方法:1、接種細(xì)胞懸液100l于96孔板內(nèi)，預(yù)先置于37，5% CO 2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2、在每個(gè)孔內(nèi)加入10l的CCK-8試劑。3、把培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時(shí)*。4、在450nm波長(zhǎng)處測(cè)

20、定吸光度，參比波長(zhǎng)為600nm或600nm以上。解決方法3：使用MTS解決方法4：加入DMSO在同一批實(shí)驗(yàn)中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒(méi)有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀會(huì)很難溶解.二培養(yǎng)液的顏色在檢測(cè)時(shí)也能被測(cè)到,會(huì)對(duì)最后結(jié)果造成影響。但前提是不能把細(xì)胞也一起吸掉，因?yàn)檫@樣帶來(lái)的誤差要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培養(yǎng)液沒(méi)棄干凈帶來(lái)的誤差,所以要在保證細(xì)胞不被吸掉的前提下，盡量把培養(yǎng)液吸掉。如果培養(yǎng)液沒(méi)棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測(cè)時(shí)可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul.1.加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩510min, 時(shí)間控制盡量嚴(yán)格一

21、點(diǎn),放置時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)影響結(jié)果,值會(huì)偏大,且結(jié)果不可信.2.加入DMSO后可用排槍反復(fù)抽吸助溶，溶解后盡快檢測(cè)。如果實(shí)驗(yàn)孔不多，建議用此法，因其比振蕩溶解效果好。3.或放入37度放孵箱15分鐘溶解結(jié)晶。振蕩是為了讓甲臜溶解，這樣才能更好的測(cè)量吸光度，振蕩96孔板有專(zhuān)的振蕩器，目的:扎破氣泡.有氣泡存在時(shí),由于其對(duì)光的反射與折射作用(酶標(biāo)儀的原理是通過(guò)測(cè)定特定波長(zhǎng)透過(guò)樣品的吸光度推測(cè)樣品內(nèi)特定物質(zhì)的濃度),會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏移.OD值的測(cè)定至于測(cè)定波長(zhǎng)的選擇是因顯色溶液而異的，對(duì)于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO，它的測(cè)定波長(zhǎng)是570。(就

22、如ELISA實(shí)驗(yàn)選用OPD作底物測(cè)定波長(zhǎng)是492，選用TMB顯色液則用450);而對(duì)于SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，并且建議以655nm作為參考波長(zhǎng)。DMSO溶后10分鐘內(nèi)測(cè)，越放顏色越深，而做為溶解液測(cè)吸收光值，其值可在三天內(nèi)保持不變.細(xì)胞密度偏大測(cè)出的吸光度也會(huì)偏大，細(xì)胞密度小吸光度也會(huì)偏?。涣硗飧?xì)胞狀態(tài)也有關(guān)系，細(xì)胞狀態(tài)不好的話，吸光度值也會(huì)低的；細(xì)胞數(shù)目少，或者是培養(yǎng)的時(shí)間短，OD值也會(huì)偏低。如果各個(gè)孔的孔間差異性特別明顯的話說(shuō)明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是細(xì)菌污染。復(fù)孔直接的OD值差別一般應(yīng)在0.10.15，差別太大考慮：1.接種細(xì)胞數(shù)不均勻，或是接種太多，

23、應(yīng)保證每孔一致，一般是每孔100010000個(gè)。可以細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入細(xì)胞懸液，再補(bǔ)培養(yǎng)基到預(yù)定體積，并輕輕吹打幾次，使細(xì)胞均勻分布，這樣比直接加入預(yù)定體積的細(xì)胞懸液要好，接種時(shí)應(yīng)加含血清培養(yǎng)基。2.貼壁時(shí)間：1824h，如果不夠，未懸浮的細(xì)胞會(huì)被吸掉。一般為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確，每個(gè)濃度可以設(shè)56個(gè)復(fù)孔，可以最后統(tǒng)計(jì)時(shí)，可以除去一個(gè)最高值和一個(gè)最低值，或者除去其中數(shù)據(jù)離譜的值，這些離譜數(shù)字的出現(xiàn)與細(xì)胞是否污染，細(xì)胞是否在培養(yǎng)期間死去，是否培養(yǎng)液蒸發(fā)過(guò)多，加MTT液是否準(zhǔn)確，在37，5二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育時(shí)間是否一定（14小時(shí)）等有密切的關(guān)系，當(dāng)然測(cè)定OD值的儀器工作狀態(tài)是否正常也非常重要！(一般開(kāi)

24、機(jī)預(yù)熱20min)。MTT方法的吸收度在0.20.8之間誤差較小。這和分析化學(xué)中的-beer定律有關(guān)， 對(duì)朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈直線的情況，特別是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時(shí)，明顯地看到通過(guò)原點(diǎn)向濃度軸彎曲的現(xiàn)象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱(chēng)為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進(jìn)行定量，將會(huì)引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測(cè)量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來(lái)源。任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差。這些誤差可能來(lái)源于光源不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)條件偶然變動(dòng)，讀數(shù)不準(zhǔn)確等。在光度計(jì)中，透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對(duì)于同一儀器，讀數(shù)的波動(dòng)對(duì)透射比為一定值；而對(duì)吸光度讀數(shù)波動(dòng)則不

25、再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動(dòng)所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時(shí)，濃度測(cè)量誤差都較大，即光度測(cè)量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測(cè)溶液的透射比T在15%65%之間，或使吸光度A在0.20.8之間，才能保證測(cè)量的相對(duì)誤差較小。當(dāng)!/url<font color=#ff0000>謝絕廣告帖！再發(fā)封ID！</font>0.434(或透射比T=36.8%)時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小。其它的聲音：1.最好用570nm波長(zhǎng)的濾光片，因?yàn)镸TT在這個(gè)波長(zhǎng)的吸光度是峰值，換句話說(shuō)靈敏度高。用其它波長(zhǎng)的也有，一般是490nm，但我的經(jīng)驗(yàn)靈敏度降低一半。2.我們用的BIO-

26、TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果復(fù)孔之間值相差太大就要考慮是否是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差. 我曾經(jīng)看到園子的有些帖子報(bào)道說(shuō)OD值大概在0.2-1.2范圍內(nèi)與活細(xì)胞數(shù)有較好的線性關(guān)系，但OD值在0.3-0.9范圍內(nèi)可能更佳，若你的OD值不在這個(gè)范圍內(nèi)則你實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)可能不太合適，應(yīng)調(diào)整你的細(xì)胞數(shù)。邊緣效應(yīng)96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養(yǎng)細(xì)胞，否則這四行的數(shù)據(jù)會(huì)偏高或偏低,96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，由于溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不同。對(duì)于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開(kāi)關(guān)培養(yǎng)箱的次

27、數(shù)和時(shí)間。解決方法:將孔板周?chē)囊蝗兹坎挥?，影響非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養(yǎng)液，只要能防止蒸發(fā)就可以.關(guān)于如何計(jì)算IC50(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率舉個(gè)例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計(jì)算公式：Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0

28、.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025(2)Bliss法:自己查閱書(shū)籍(3)IC50計(jì)算軟件，見(jiàn)下面附件（4）自己用EXCEL做趨勢(shì)線來(lái)求IC50，關(guān)于LD50的方法與此相似?。?）在線求IC50或EC50：http:/chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)值以x±s表示，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，p<0.05時(shí)為相差顯著，p<0.

29、01時(shí)為相差非常顯著?？梢砸詴r(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線，專(zhuān)門(mén)公式求IC50?；蛴?jì)算抑制率。細(xì)胞死亡率%=OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組excel表中可以做兩兩比較的T-test,這個(gè)你可以參考一下；你的數(shù)據(jù)應(yīng)該用多個(gè)樣本均數(shù)的T-test，方差分析也可。用的軟件是SPSS或者SAS?？装宓闹貜?fù)利用:培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。一般貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用重復(fù)利用的培養(yǎng)板效果不是很好，因?yàn)榕囵B(yǎng)板表層在生產(chǎn)時(shí)涂有一層促進(jìn)細(xì)胞貼壁的物質(zhì)，在清洗后多半會(huì)失去。懸浮或是半懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞還可以。建議不要用太多次，即使是進(jìn)口的板子使用次數(shù)也不要超過(guò)3次,底值最好在測(cè)得值的1/3一下。強(qiáng)烈建議培養(yǎng)板不要重復(fù)使用:1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)帖壁不好，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢等情況.2、這樣的板子消毒滅菌很不徹底，如果有萬(wàn)一,則因小失大.3、重復(fù)用的板子洗不干凈在培養(yǎng)過(guò)程中易出現(xiàn)雜質(zhì).重