靶向大鼠CTGF的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和作用分析

1、靶向大鼠CTGF的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和作用分析 作者：郎明健，曾秋棠，郭敏，楊漢東，閔新文 【摘要】 目的: 構(gòu)建并篩選靶向大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的shRNA表達(dá)載體. 方法: 根據(jù)大鼠CTGF mRNA序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個(gè)靶向大鼠CTGF基因的shRNA干擾質(zhì)粒；然后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠心肌成纖維細(xì)胞，流式細(xì)胞技術(shù)分選出成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞. 通過(guò)RTPCR和Western Blot技術(shù)對(duì)成功構(gòu)建的4個(gè)shRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行有效性篩選，分析其CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平. 結(jié)果: 酶切證實(shí)轉(zhuǎn)錄shRNA的目的基因片段已成功克隆入載體，經(jīng)測(cè)序證明與設(shè)計(jì)的相同；在

2、轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞48 h后，與空白對(duì)照組比較，有3組細(xì)胞CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低；而轉(zhuǎn)染非特異陰性質(zhì)粒對(duì)照組CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化. 結(jié)論: 成功構(gòu)建并篩選出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒重組體，為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外心肌纖維化的RNA干擾研究奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子;RNA干擾;質(zhì)粒;轉(zhuǎn)染;心內(nèi)膜；心肌纖維化 【Abstract】 AIM: To construct and screen out the potent shorthairpin RNA (shRNA)expressing plasmids which target to

3、 rat connective tissue growth factor (CTGF). METHODS: Four shRNAexpressing plasmids targeting to rat CTGF mRNA (Accession No: NM_022266) were designed and constructed based on the sequence of rat CTGF mRNA. The recombinant plasmids were identified by restriction enzyme assay and nucleotide sequence

4、analysis. Then the plasmids were transfected into rat cardiac fibroblasts using lipofectamine2000 reagent, and the positive cells were sorted by fluorescence active cell sorting (FACS) technique. The mRNA and protein expressions of CTGF were analyzed by RTPCR and Western Blot technique, and compared

5、 with thatof nontransfection group and negative control plasmid. RESULTS: The 4 recombinant plasmid vectors expressing CTGFtargeting shRNA were identified by restriction enzyme assay and sequence analysis. Fortyeight hours posttransfection, the mRNA and protein expressions of CTGF decreased in 3 exp

6、erimental groups compared with that in nontransfection group, but no changes occurred in negative control plasmid and lipofectamine2000 group. CONCLUSION: Four recombinant plasmids targeting to rat CTGF are successfully constructed, and 3 potent recombinant plasmids are screened out. This lays a fou

7、ndation for further researches of RNA interference on cardiac fibrosis in vivo and in vitro. 【Keywords】 connective tissue growth factor; RNA interference; plasmid; transfect; cardiac fibrosis0引言 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor, CTGF）是一種促組織纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在多種器質(zhì)性纖維化疾病如腎間質(zhì)纖維化、肝硬化、皮膚瘢痕的形成等中均起關(guān)鍵作

8、用1-3. 近年來(lái)也有研究提示CTGF可能參與了心肌纖維化的發(fā)生4-5. RNA干擾（RNA interference, RNAi）是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，是比基因敲除、反義寡核苷酸干擾更有前途的作用于mRNA水平的干擾技術(shù)，具有相對(duì)簡(jiǎn)單、抑制作用更為完全、特異性高等特點(diǎn)，在高通量研究基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及進(jìn)行靶向基因靜默治療等方面廣泛應(yīng)用. 本研究通過(guò)構(gòu)建并篩選CTGF靶向特異性的shRNA（shorthairpin RNA）真核表達(dá)載體，為今后通過(guò)RNAi技術(shù)抑制CTGF表達(dá)、從基因與蛋白質(zhì)水平探索CTGF在促心肌纖維化的作用打下基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料真核表達(dá)載體pGene

9、sil1質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌DH5購(gòu)自武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶BamH I, Hind , Sal I, Pst I和T4多聚核苷酸激酶及其緩沖液均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司;T4 DNA連接酶及緩沖液購(gòu)自New England Biolabs;凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自寧波中鼎生物技術(shù)有限公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000購(gòu)于Invitrogen;山羊抗大鼠CTGF多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz;HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗及ECL試劑盒購(gòu)于Pierce公司. 1.2方法 1.2.1CTGF靶向性shRNA序列的設(shè)計(jì)與合成CTGF靶向性s

10、hRNA干擾序列的設(shè)計(jì)合成參見(jiàn)文獻(xiàn)6. 簡(jiǎn)言之，從GenBank上選取大鼠CTGF的基因序列(序列號(hào)NM_022266)，用專業(yè)RNAi設(shè)計(jì)軟件結(jié)合個(gè)人經(jīng)驗(yàn)優(yōu)選四段序列為靶序列，同時(shí)設(shè)計(jì)一對(duì)非特異性序列作為對(duì)照，并與大鼠基因組進(jìn)行BLAST比對(duì)，驗(yàn)證均為單一基因. 然后進(jìn)行以上寡核苷酸DNA單鏈的合成，并退火連接形成雙鏈. 1.2.2靶向大鼠CTGF的 shRNA表達(dá)載體的重組構(gòu)建及鑒定CTGF靶向性干擾質(zhì)粒的克隆重組、限制性內(nèi)切酶分析及測(cè)序鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn)6. 首先，線性化處理目的質(zhì)粒，再把基因片段與線性化質(zhì)粒連接從而克隆重組成新的靶質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5，在含Kana抗性（終濃度為20

11、 g/mL）的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將提取得到的重組的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒用Pst I和Sal I進(jìn)行酶切分析并進(jìn)行測(cè)序鑒定. 1.2.3大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)取出生12 d的SD乳鼠(購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)消毒后無(wú)菌操作取心尖組織，剪碎成1 mm3大小，加入適量含0.8 g/L胰蛋白酶和0.5 g/L膠原酶混合液，37水浴下機(jī)械混勻，完全消化，加入含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心棄上清，制備成細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶，差速貼壁60 min去除心肌細(xì)胞，用含100 mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37, 50 mL/L CO2

12、培養(yǎng)環(huán)境中恒溫培養(yǎng). 以后每2 d換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底后傳代繼續(xù)培養(yǎng). 取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn). 1.2.4心肌成纖維細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染及流式分選將培養(yǎng)至第3代的心肌成纖維細(xì)胞以1.25 g/L胰酶消化離散，接種于6孔板繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板密度達(dá)90%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)分為如下6組：空白對(duì)照組（即單純細(xì)胞組）,陰性對(duì)照HK質(zhì)粒組,1號(hào)質(zhì)粒組,2號(hào)質(zhì)粒組,3號(hào)質(zhì)粒組,4號(hào)質(zhì)粒組. 參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000試劑盒操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞. 為純化轉(zhuǎn)染成功的陽(yáng)性細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h后對(duì)所有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（14號(hào)質(zhì)粒及陰性HK質(zhì)粒）進(jìn)行流式細(xì)胞分選. 分選出的5組細(xì)胞及空

13、白對(duì)照細(xì)胞進(jìn)入后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn). 1.2.5RNA的提取及半定量RTPCR檢測(cè)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，在刺激時(shí)相點(diǎn)結(jié)束后，加入TRIZOL提取細(xì)胞總RNA，以30 L去RNase水溶解，采用紫外分光光度儀測(cè)定濃度，利用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量. RTPCR檢測(cè)采用兩步法進(jìn)行. 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程以Random 9 mers為隨機(jī)引物，AMV為逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)條件為：30保溫10 min,44聚合延伸30 min, 99滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min, 5穩(wěn)定5 min. PCR過(guò)程以3磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照. CTGF上下游引物序列分別為5GCTGGGGCTCACCTGAAGG3和5GGATGACCT

14、TGCCCACAGCC3，擴(kuò)增長(zhǎng)度499 bp; GAPDH上下游引物序列分別為5CCTGACCCAACTATGATGC3和5CCCTTACTCCCTGGCTTT3，擴(kuò)增長(zhǎng)度為343 bp. 引物均用Primer5.0設(shè)計(jì)，送上海生物工程有限公司合成. PCR反應(yīng)條件如下：95變性5 min； 然后95變性1 min,55退火1 min,72延伸1 min,共計(jì)30個(gè)循環(huán)；最后72延伸7 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，拍照并經(jīng)過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)電泳帶進(jìn)行分析，測(cè)定各目的基因和GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光值，分別計(jì)算其比值. 1.2.6蛋白提取及Western Blot檢測(cè)根

15、據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，以冰PBS洗滌細(xì)胞，按照5106個(gè)細(xì)胞加入50uL蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，蛋白提取液在4條件下以12 000 g離心20 min，取上清，采用紫外分光光度儀用Bradford方法測(cè)定蛋白濃度后分裝，-70保存. 取上述細(xì)胞蛋白提取液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）. 將電泳分離后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，置于50 g/L脫脂奶粉的PBS中封閉3 h后分別加入CTGF（1400），F(xiàn)N（1500）多克隆抗體4孵育過(guò)夜后，硝酸纖維素膜用3 g/L的TweenPBS液反復(fù)沖洗3次，每次15 min. 將沖洗后的膜置于辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG中，室溫下?lián)u床上孵育2 h.

16、用3 g/L的TweenPBS液反復(fù)沖洗3次，每次15 min. 并以兔抗大鼠actin（1500）多克隆抗體同上操作，作為上樣對(duì)照. 抗原抗體復(fù)合物用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence, ECL）法顯影，暗室X光膠片曝光，采用GELW4D軟件分析蛋白條帶的積分光密度值（integrated optical density, IOD=平均光密度面積），以IOD靶蛋白/IODactin的比值反映靶蛋白相對(duì)水平. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理, 數(shù)據(jù)以xs表示，多個(gè)均數(shù)比較用單因素方差分析,兩個(gè)均數(shù)比較用t檢驗(yàn). P<0.05為

17、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 2結(jié)果 2.1選定的靶序列及針對(duì)每條靶序列設(shè)計(jì)的雙鏈shRNA靶序列結(jié)構(gòu)模式：BamHI+Sense+Loop+Antisense+ 終止信號(hào)+SalI+HindIII CTGF1: AAGGGTCTCTTCTGCGACTTC; CTGF1A: 5GATCCGGGTCTCTTCTGCGACTTCTTCAAGACGGAAGTCGCAGAAGAGACCCTTTTTTGTCGACA3; CTGF1B: 3GCCCAGAGAAGACGCTGAAGAAGTTCTGCCTTCAGCGTCTTCTCTGGGAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF2: AAAGATGGTGCACCCT

18、GTGTC; CTGF2A: 5GATCCAGATGGTGCACCCTGTGTCTTCAAGACGGACACAGGGTGCACCATCTTTTTTTGTCGACA3; CTGF2B: 3GTCTACCACGTGGGACACAGAAGTTCTGCCTGTGTCCCACGTGGTAGAAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF3: GAGTCCTTCCAAAGCAGTT; CTGF3A: 5GATCCGAGTCCTTCCAAAGCAGTTCTATGGACAAACTGCTTTGGAAGGACTCTTTTTTGTCGACA3; CTGF3B: 3GCTCAGGAAGGTTTCGTCAAGATAC

19、CTGTTTGACGAAACCTTCCTGAGAAAAAACAGCTGTTCGA5; CTGF4: CCGATGGCGAGATCATGAA; CTGF4A: 5GATCCGCCGATGGCGAGATCATGAATTCAAGACGTTCATGATCTCGCCATCGGTTTTTTGTCGACA3; CTGF4B: 3GCGGCTACCGCTCTAGTACTTAAGTTCTGCAAGTACTAGAGCGGTAGCCAAAAAACAGCTGTTCGA5. 以上各序列中畫(huà)橫線部分為正義及反義序列，斜體加粗部分為shRNA的環(huán)區(qū)序列，兩端的框中為BamHI和Hind部分酶切殘基，退火成雙鏈后能夠形成酶切

20、位點(diǎn)的粘性末端，可與工具質(zhì)粒相應(yīng)的黏性末端連接；其余部分為終止信號(hào)+SalI. 構(gòu)建好的質(zhì)粒重組體分別命名為CTGF14. 2.2心肌成纖維細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞2448 h后，倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)各轉(zhuǎn)染組心肌成纖維細(xì)胞在成功轉(zhuǎn)染后可被激發(fā)出亮綠色熒光，粗略估測(cè)轉(zhuǎn)染效率約30%40%（圖1）. 圖1熒光顯微鏡下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果100 2.3心肌成纖維細(xì)胞的流式分選流式細(xì)胞分選表明，以Lipofectamine2000進(jìn)行心肌成纖維細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率僅約為30%（圖2）. M1:成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞比率; A:陰性對(duì)照; B:陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞. 圖2心肌成

21、纖維細(xì)胞流式分選結(jié)果 2.4不同實(shí)驗(yàn)組心肌成纖維細(xì)胞CTGF mRNA的表達(dá)半定量RTPCR結(jié)果顯示，序列非特異性的陰性對(duì)照質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞CTGF基因表達(dá)無(wú)下調(diào)效應(yīng).4個(gè)待篩選的目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，表現(xiàn)出不同的抑制效應(yīng)，其中在轉(zhuǎn)染1號(hào)質(zhì)粒的細(xì)胞未表現(xiàn)出抑制效果，轉(zhuǎn)染2, 3, 4號(hào)質(zhì)粒后有明顯抑制效應(yīng)，尤其以3號(hào)質(zhì)?；虺聊饔米顝?qiáng)（圖3）. 2.5不同實(shí)驗(yàn)組心肌成纖維細(xì)胞的CTGF蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，序列非特異性的陰性對(duì)照質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)無(wú)下調(diào)效應(yīng)；4個(gè)待篩選的目標(biāo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后， 1號(hào)質(zhì)粒未表現(xiàn)出任何抑制效果，2, 3, 4號(hào)質(zhì)粒有明顯抑制效應(yīng)，尤其以3號(hào)

22、質(zhì)粒抑制作用最強(qiáng)，約75%（圖4）. 3討論 CTGF是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一， 它可能是TGF1促纖維化活性的下游信號(hào)介質(zhì)，刺激細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的形成，在組織纖維化中有重要作用. 研究發(fā)現(xiàn)在高血壓、粥樣硬化病變中以及心肌梗死灶中CTGF表達(dá)明顯增高，并與纖維化指標(biāo)正相關(guān)，提示CTGF可能是致心肌纖維化的關(guān)鍵性中間環(huán)節(jié)7-9. 通過(guò)靶向抑制CTGF從而抑制纖維化的發(fā)生和發(fā)展理論上是抗纖維化的有效方式，已有研究應(yīng)用抗CTGF的單克隆抗體FG3019或針對(duì)CTGF的反義寡核苷酸用于抑制腎間質(zhì)纖維化、肺纖維化并取得一定進(jìn)展10-11. RNA干擾（RNAi）是作用于mRNA水平的基因沉默技術(shù)

23、,其機(jī)制可能是細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA在Dicer酶的作用下，可形成2123 bp大小的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，精確降解與siRNA序列相同的mRNA，抑制了該基因在細(xì)胞內(nèi)的翻譯和表達(dá)從而達(dá)到轉(zhuǎn)錄后水平的基因靜默12-15. 由于siRNA表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染后可進(jìn)行瞬時(shí)或穩(wěn)定的基因沉默，因此相較于化學(xué)合成的siRNA更有應(yīng)用價(jià)值和前景. 本研究應(yīng)用OptiRNA設(shè)計(jì)軟件結(jié)合個(gè)人經(jīng)驗(yàn)設(shè)計(jì)了4條針對(duì)大鼠CTGF基因的靶向干擾序列，經(jīng)BLAST證實(shí)與大鼠基因組其他基因無(wú)同源性，因此具備了靶向特異性的特點(diǎn). 我們構(gòu)建的CTGFshRNA質(zhì)粒重組體使用了U6啟動(dòng)子啟

24、動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄以及Pol識(shí)別的終止信號(hào)終止轉(zhuǎn)錄，符合siRNA表達(dá)載體的設(shè)計(jì)要求；通過(guò)酶切實(shí)驗(yàn)和基因測(cè)序也證實(shí)目標(biāo)質(zhì)粒構(gòu)建成功. 另外，本質(zhì)粒含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白編碼基因，成功轉(zhuǎn)染后能在細(xì)胞內(nèi)借助U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出綠色熒光蛋白，通過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀可非常方便的評(píng)估轉(zhuǎn)染效率或進(jìn)行細(xì)胞分選，為成功的RNA干擾實(shí)驗(yàn)提供支撐. 由于我們?cè)缙谶M(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000對(duì)心肌成纖維細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染其轉(zhuǎn)染效率僅有30%40%，達(dá)不到進(jìn)行理想的基因干擾實(shí)驗(yàn)的要求. 因此，為了提高篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，本實(shí)驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行了流式分選. 由于

25、分選出的陽(yáng)性細(xì)胞基本上都是已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒的心肌成纖維細(xì)胞，因此最大限度減少了篩選實(shí)驗(yàn)假陰性結(jié)果的發(fā)生. 通過(guò)檢測(cè)CTGF mRNA與蛋白的表達(dá)水平，我們比較了4個(gè)目標(biāo)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)差異. 結(jié)果表明，CTGF2,3,4號(hào)干擾質(zhì)粒均可有效地抑制CTGF mRNA及蛋白的表達(dá)，尤其以3號(hào)干擾質(zhì)粒基因沉默效果更為顯著，抑制效率可達(dá)75%以上，說(shuō)明CTGF shRNA可高效特異抑制CTGF的表達(dá). 而CTGF1干擾質(zhì)粒無(wú)明顯抑制效率，說(shuō)明并非所有設(shè)計(jì)的siRNA均可有效地抑制靶基因的表達(dá)，因此，RNA干擾實(shí)驗(yàn)要求通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有

26、效的siRNA序列. 陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組相比CTGF mRNA表達(dá)無(wú)明顯改變，排除了質(zhì)粒載體本身、非特異性的靶基因?qū)TGF基因表達(dá)的影響. 綜上所述，本研究成功設(shè)計(jì)并構(gòu)建了4個(gè)靶向CTGF的shRNA質(zhì)粒，并通過(guò)篩選實(shí)驗(yàn)獲得了高效及靶向特異的目標(biāo)質(zhì)粒. 為后續(xù)心肌纖維化的體內(nèi)外RNA干擾研究及進(jìn)一步探索CTGF在心肌纖維化及心臟的組織重塑中的地位與作用奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】 1 Duncan MR, Frazier KS, Abramson S, et al. Connective tissue growth factor mediates transforming growth fa

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