芍藥苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響

1、芍藥苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響 作者：常蘊(yùn)青 趙中夫 劉明社【摘要】 目的：觀察芍藥苷對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠單核/巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）釋放和表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)三代后，轉(zhuǎn)種于放置了無(wú)菌處理蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為對(duì)照組、LPS刺激組（100 ng/mL）、芍藥苷組（LPS 100 ng/mL芍藥苷0.625 mg/mL）；LPS刺激20 h后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組培養(yǎng)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)水平。結(jié)果：LPS刺激RAW 264.7細(xì)胞20 h后，LPS組細(xì)胞核HMGB1特異性染色變淡

2、，胞漿染色加深，表明HMGB1從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿; 芍藥苷組大部分細(xì)胞核HMGB1特異性染色深，而胞漿染色淺，表明芍藥苷抑制HMGB1從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿。對(duì)HMGB1免疫組化數(shù)字圖像的累積光密度值分析顯示，HMGB1含量在三個(gè)實(shí)驗(yàn)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=918.67，P<0.01），LPS刺激組和芍藥苷組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=22.66,P<0.01）。結(jié)論：芍藥苷可能通過(guò)抑制HMGB1的核轉(zhuǎn)位和釋放，對(duì)LPS誘導(dǎo)的肝損傷起保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 芍藥苷；脂多糖；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；高遷移率族蛋白B1 Abstract Objective：To investigate

3、 the effects of paeoniflorin on the expression of high mobility group box1(HMGB1) in RAW264.7 macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods: RAW264.7 Macrophages were cultured to the third generation in six wells plate and divided into three groups : control group, 100 ng/mL LPS treatment

4、 group and 0.625 mg/mL paeoniflorin treatment group. After 20h treatment, the expression of HMGB1 was measured by immunohistochemical method . Results: At 20 h after RAW264.7 cells stimulated by LPS, LPS group showed nucleus HMGB1-specific stained light, cytoplasm stained deepened. It was indicated

5、that HMGB1 was transfered from the nucleus to the cytoplasm. Paeoniflorin group showed the release of HMGB1 of the majority of cells was inhibited. HMGB1-specific staining nuclei became darker. cytoplasm staining shallow. Integrated optical density of HMGB1 immunohistochemic digital image analysis s

6、howed that HMGB1 among three groups were significantly different (F=918.67，P<0.01). The difference between LPS group and Paeoniflorin groups was statistical significance（q=22.66,P<0.01）. Conclusion: Paeoniflorin can protect liver injury under LPS stimulation through inhibiting the tran

7、fer and release of HMGB1. Key words Paeoniflorin;Lipopolysaccharide;RAW264.7 macrophages;High mobility group box 1(HMGB1) 芍藥苷(paeoniflorin，Pae) 為一種蒎烷單萜苷，主要存在于毛莨科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall）的根皮部，以中藥赤芍中含量最高，毒性極低，具有鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和保肝等作用。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激小鼠巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型，觀察芍藥苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW2

8、64.7細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響，以探討芍藥苷對(duì)其是否具有保護(hù)作用，進(jìn)而深入了解芍藥苷抗炎作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)防治肝病的藥物提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 主要試劑 芍藥苷：南京替斯艾么中藥研究所；小鼠單核/巨噬細(xì)胞株(RAW264.7)：中科院上海細(xì)胞庫(kù)；HMGB1抗體：英國(guó) Abcam公司；新生牛血清（FCS）：杭州四季青公司產(chǎn)品；RPMI-1640：美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶：美國(guó)Sigma公司；EDTA：華美生物工程公司； UltraSensitiveTM SP超敏試劑盒：福州邁新公司；Tritonx-100：北京中山試劑公司；LPS：美國(guó)Sigma公司。 1.2 實(shí)驗(yàn)

9、方法 1.2.1. RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)：復(fù)蘇后的RAW264.7細(xì)胞置于含100 U/mL青霉素、100 U/mL 鏈霉素、10新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。為防止LPS干擾，培養(yǎng)基中加入了10 g/mL的多粘菌素B。37 、5CO2孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合80后，以0.25胰蛋白酶1 mmol/L EDTA溶液消化傳代。 1.2.2 細(xì)胞活性鑒定：臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)：將刺激后的細(xì)胞用EDTA消化后吹打成單細(xì)胞懸液，取0.5 mL 0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液、0.3 mL HBSS和0.2 mL細(xì)胞懸液，充分混勻。用毛細(xì)吸管吸取少量混合液，注入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板小室

10、，計(jì)數(shù)其中著色的細(xì)胞。 細(xì)胞活力=(總細(xì)胞數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100% 1.2.3. 芍藥苷抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞HMGB1釋放的免疫組化實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)板作好標(biāo)志分別為A板、B板、C板，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組（A1-A6）：培養(yǎng)液1 mL；LPS組（B1-B6）：培養(yǎng)液+ LPS 100 ng/mL；芍藥苷組(C1-C6)：培養(yǎng)液+LPS 100 ng/mL+Pae 0.625 mg/mL。各孔細(xì)胞在受LPS刺激前先換成無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，孵育2 h后以相應(yīng)劑量的LPS刺激，均于刺激20 h后，小心取出培養(yǎng)孔內(nèi)載玻片，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。棄去培養(yǎng)液，

11、PBS洗2次；4的多聚甲醛固定15 min, PBS洗3次，每次3 min;每張切片加一滴H2O2阻斷劑溶液，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min; 每張切片加一滴非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育10 min;加入含0.3Tritonx-100的PBS，37 孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min; 除陰性對(duì)照孔外，每張切片加一滴1250稀釋的抗體，4 過(guò)夜; 次日晨，從冰箱取出，室溫下30 min,PBS洗3次，每次3 min;每張切片加一滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次3 min; 每張切片加一滴鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，室溫孵育10 min

12、，PBS洗3次，每次3 min; 每張切片加二滴DAB顯色劑，顯微鏡下觀察3 min，自來(lái)水沖洗1 min，蘇木素復(fù)染2 min，Hcl-酒精分色30 s，PBS返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片，晾干。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 顯微鏡下觀察并拍照，選取染色清晰的切片5張，于光鏡下(×20)隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用OLYMPUS-BX51圖像采集系統(tǒng)，Image-Pro5.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定累積光密度值（IOD）。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS12.0軟件包分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為

13、差異有顯著性。 2 結(jié)果 2.1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性無(wú)明顯改變 經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力均大于95%，表明實(shí)驗(yàn)所加各種物質(zhì)沒(méi)有影響RAW264.7細(xì)胞的活力，排除細(xì)胞壞死HMGB1的被動(dòng)釋放因素。 2.2. 芍藥苷抑制 RAW264.7細(xì)胞釋放HMGB1 LPS刺激RAW264.7細(xì)胞20 h后免疫組化結(jié)果顯示: 正常培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞未刺激時(shí)HMGB1聚集在細(xì)胞核內(nèi)，胞漿淡染；LPS組表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大，偽足伸出，細(xì)胞核HMGB1特異性染色變淡，部分細(xì)胞胞核染色變藍(lán)，胞漿染色加深。芍藥苷組細(xì)胞體積改變不明顯，大部分細(xì)胞HMGB1的釋放被抑制，細(xì)胞核HMGB1特異性染色深，胞漿染

14、色淺(見(jiàn)圖1)。 2.3. 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞釋放HMGB1免疫組化的IOD檢測(cè)結(jié)果 各組細(xì)胞釋放HMGB1免疫組化結(jié)果的數(shù)字圖像經(jīng)Image-Pro5.0分析處理后，其細(xì)胞HMGB1含量的IOD值（x±s）為：對(duì)照組0.054±0.003；LPS刺激組0.176±0.009；芍藥苷組0.130±0.005。ANOVA分析表明三個(gè)實(shí)驗(yàn)組間胞漿的HMGB1含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=918.67, P<0.01）；LPS刺激組和芍藥苷組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=22.66,P<0.01），LPS刺激組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=60.

15、02,P<0.01），芍藥苷組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=37.36,P<0.01）。 3 討論 RAW264.7細(xì)胞是被廣泛用于體外實(shí)驗(yàn)的巨噬細(xì)胞系，當(dāng)受到LPS刺激后能表達(dá)和釋放包括HMGB1在內(nèi)的多種細(xì)胞因子。HMGB1是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的非組蛋白染色體蛋白，多種器官(如淋巴組織、腦、肝、肺、心、脾、腎等)的細(xì)胞中均有表達(dá)，位于大多數(shù)細(xì)胞的胞核和胞漿內(nèi)，它可參與DNA的復(fù)制、細(xì)胞分化及基因表達(dá)等多種細(xì)胞生命活動(dòng)。HMGB1除了由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放外可由多種細(xì)胞主動(dòng)釋放，如人外周血單個(gè)核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等4。HM

16、GB1一旦釋放到細(xì)胞外介質(zhì)，它就能激活免疫反應(yīng)。Wang等發(fā)現(xiàn)，用內(nèi)毒素、TNF或IL-1刺激培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞 8 h后在細(xì)胞培養(yǎng)液上清可檢測(cè)到HMGB1。用亞致死量?jī)?nèi)毒素攻擊小鼠,8 h檢測(cè)到血漿HMGB1，16 h達(dá)高峰，并持續(xù)至32 h，研究結(jié)果顯示HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的病理生理過(guò)程。近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在各種急性炎癥條件下，HMGB1在細(xì)胞外或胞漿中的表達(dá)與肺炎、膿毒癥、內(nèi)毒素血癥等急性炎癥病情相關(guān)，。肝臟中有大量的巨噬細(xì)胞存在，急性肝損傷和肝衰竭時(shí)又往往并發(fā)內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素血癥能誘導(dǎo)肝臟HMGB1表達(dá)增強(qiáng)。HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)在膿毒癥、

17、內(nèi)毒素血癥等炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中具有核心作用。赤芍是我國(guó)傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥，有著悠久的用藥歷史, 它的藥學(xué)功效被記錄到神農(nóng)本草經(jīng),具有清熱涼血，散瘀止痛之功能，主要用于熱入營(yíng)血、斑疹吐衄、經(jīng)閉瘕、跌打損傷、痛腫瘡毒、目赤翳障等癥。芍藥苷是赤芍的主要有效成分,大量的臨床研究證實(shí)芍藥苷有抗炎、抗?jié)?、保肝、免疫調(diào)節(jié)等多方面的藥理作用。然而，芍藥苷是否能抑制HMGB1的表達(dá)和釋放，對(duì)抗內(nèi)毒素血癥引起的肝損傷而發(fā)揮保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞是小鼠腹腔巨噬細(xì)胞株，具有肝臟枯否細(xì)胞的功能，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠反映肝損傷時(shí)枯否細(xì)胞機(jī)制變化。實(shí)驗(yàn)中，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞2

18、0 h后，我們采用免疫組化法觀察了巨噬細(xì)胞HMGB1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：正常培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞未刺激時(shí)HMGB1聚集在細(xì)胞核內(nèi)，LPS刺激20 h后大部分細(xì)胞HMGB1從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿，細(xì)胞體積增大，偽足伸出，細(xì)胞核HMGB1特異性染色變淡，部分細(xì)胞胞核染色變藍(lán)，胞漿染色加深。芍藥苷組細(xì)胞體積改變不明顯，大部分細(xì)胞HMGB1的釋放被抑制，細(xì)胞核HMGB1特異性染色變深，胞漿染色變淺，表明芍藥苷可以抑制HMGB1的核轉(zhuǎn)位。 最近研究表明，急性肝損傷時(shí)肝臟巨噬細(xì)胞受LPS刺激時(shí)HMGB1從胞核轉(zhuǎn)移到胞漿是其釋放的前提，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：芍藥苷對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制晚

19、期炎癥介質(zhì)HMGB1的核轉(zhuǎn)位和釋放而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)初步探討了活血化淤類中藥抗炎作用機(jī)制，為臨床抗炎中藥的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。【參考文獻(xiàn)】 Ye J, Duan H, Yang X,et al.Antithrombosis effect of paeoniflorin: Evaluated in a photochemical reaction thrombosis model in vivo.Planta Med,2001，67 (8): 766767. McKessar SJ，Betty AM, Bell JM，et al.Genetic charactcrimion of VanG,a n

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