腸粘連組織中MMP3和TIMP1的表達(dá)及意義

1、腸粘連組織中MMP-3和TIMP-1的表達(dá)及意義【摘要】 目的 觀察MMP-3和TIMP-1與腸粘連的相關(guān)性及意義。方法 選取60只SD雄大鼠隨機(jī)分為兩組（n=30）,B組制成大鼠腸粘連模型，A組為正常對照組，分別于造模第2、7、14天各處死10只，分別取小腸漿膜粘連，應(yīng)用免疫組化和圖像分析的方法測定粘連組織中MMP-3和TIMP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 術(shù)后2天組，粘連組織中MMP-3和TIMP-1的含量升高，與正常對照組相比，差異有顯著性（P0.01）；術(shù)后7天組，粘連組織中MMP-3含量降低；而TIMP-1的含量升高至峰值，與術(shù)后2天組相比，差異有顯著性（P0.01）；術(shù)后14天組，粘連組織

2、中MMP-3含量繼續(xù)降低，TIMP-1的含量略為下降，但兩者含量都已基本穩(wěn)定。與術(shù)后7天組及術(shù)后2天組相比，差異均有顯著性（P0.05，P0.01）。結(jié)論 MMP-3、TIMP-1在手術(shù)后不同時(shí)期的不同表達(dá)可能在腸粘連的形成中發(fā)揮一定作用。 【關(guān)鍵詞】 基質(zhì)金屬蛋白酶-3；組織金屬蛋白酶抑制劑-1；腸粘連 【Abstract】 Objective To study the clinical significance and correlation of matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) and tissue inhibitor of matrix metal

3、loproteinase-1(TIMP-1) in intestinal adhesion. Methods Sixty SD male rats were randomly allocated to two groups, B group was 30 rats with postoperative intestinal adhesion ,A group was normal. Ten experimental rats were sacrificed on the 2nd,7th and 14th day after injection, respectively. Take adhes

4、ive tissue of small intestine respectively, the expression of MMP-3 and TIMP-1 in adhesive tissues were determined by immunohistochemistry assay and image analysis. Results The expression of MMP-3 and TIMP-1 in adhesive tissues on the 2 day after surgery were significantly higher than those of norma

5、l group(P0.01）; MMP-3 contents in adhesive tissues on the 7 day after surgery were significantly lower than the 2 day after surgery(P0.01）;but the peak time of TIMP-1 contents was on the 7 day after surgery; MMP-3 contents in adhesive tissues continued to lower on the 14 day, TIMP-1 contents descend

6、ed just a little, but both of their contents had been basic stability already. Compare to the group of 7 day after surgery and that of 2 day after surgery, there was significant difference（P0.05，P0.01）.Conclusion The different expression of MMP-3 and TIMP-1 in different period after operation might

7、play a role in intestinal adhesion formation. 【Key words】 matrix metallo proteinase-3(MMP-3)；tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1(TIMP-1)；intestinal adhesion 隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，現(xiàn)代外科手術(shù)的技術(shù)和方法也正在日新月異地向前發(fā)展，但盆腹部手術(shù)后盆腹腔粘連（主要是腸粘連）仍是亟待解決的外科難題。就盆腔粘連來說，它是婦科手術(shù)后常見的并發(fā)癥之一，發(fā)生于2/3開腹術(shù)患者中。盆腔粘連不僅是急性復(fù)發(fā)性腸梗阻最常見的原因（20%4

8、1%），并與15%20%婦女直接不育相關(guān)，也是婦女生育重建手術(shù)失敗的重要原因，還可以引起性生活不適、慢性盆腔痛等。不僅如此，盆腹腔粘連使二次手術(shù)率提高，造成二次手術(shù)的費(fèi)時(shí)、困難、危險(xiǎn)乃至致命的出血。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)可降解各類膠原、蛋白多糖及基質(zhì)蛋白，其作用可被組織蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs）所抑制1。近年來發(fā)現(xiàn)MMPs 和TIMPs 與腹腔粘連具有密切關(guān)系2。MMP和TIMP在創(chuàng)傷愈合過程中可降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的更新3?；|(zhì)金屬蛋白酶

9、-3（MMP-3）在創(chuàng)傷愈合過程中具有一定的作用4。本研究旨在探討MMP-3、TIMP-1和腸粘連的相關(guān)性,探討預(yù)防術(shù)后腸粘連的有效辦法，為指導(dǎo)治療提供一條新思路。 1 材料與方法 1.1 研究材料 60只SD雄大鼠A、B兩組各30只，其中A組為對照組，B 組制成腸粘連模型。 1.2 研究方法 B組動物均用2%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉。動物麻醉后仰臥位固定，剪毛消毒，無菌操作下取下腹正中切口，長約3cm，打開腹腔后找出回盲部，距回盲部5cm處取10 cm長的一段回腸，用干紗布反復(fù)輕輕擦拭小腸漿膜層使?jié){膜受損（約0.4cm×10cm），表面有針尖狀出血點(diǎn)。再滴一滴無水乙

10、醇于創(chuàng)面上，無齒鑷夾持盲腸系膜動脈2min,使局部缺血。然后將其放回腹腔，逐層關(guān)腹。術(shù)后動物禁食12h，分籠飼養(yǎng)，飼料為全價(jià)營養(yǎng)大鼠顆粒飼料。分別于造模后2、7、14天后再以2%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，開腹檢驗(yàn)、取材，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各取10只動物。A組SD雄大鼠30只，與模型組一樣麻醉、開腹，但不動腸組織，直接關(guān)腹，分別于術(shù)后2、7、14天開腹取腸組織。 檢測腸粘連情況：參照Phillips分級標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)具體情況評定腸粘連程度。0級：完全無粘連，回腸漿膜面修復(fù)良好；I級：回腸與周圍組織少量粘連，疏松易分離，無滲血；級：回腸與周圍組織輕到中度粘連，腸管可呈“U”形，分離時(shí)局部

11、有滲血;級：腸管與周圍組織廣泛粘連，較難分離，無腸梗阻；級：腸管與周圍組織緊密粘連成團(tuán)，分離困難，引起腸梗阻。 1.3 組織切片的免疫組織化學(xué)檢測 1.3.1 免疫組化試劑與來源 P-gp TOPOII、GST-、LRP單克隆抗體，SP-KITT9000試劑盒均由美國ZYMED公司提供，防脫片劑APES、顯色劑DAB為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。 1.3.2 組織切片的制備 每組取大鼠的創(chuàng)面部位腸管0.5cm，所有標(biāo)本經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，冰箱冷凍。將石蠟切片近小腸漿膜組織處行4m連續(xù)切片后，采用免疫組織化學(xué)S-P法篩查組織標(biāo)本中MMP-3、TIMP-1。主要操作步驟如下

12、：石蠟切片脫蠟和水化后PBS沖洗，微波修復(fù)抗原，加過氧化酶阻斷液，室溫下孵育10min,加正常山羊血清，孵育20min；滴加濃度為1：100的抗，37孵育12h，用0.1M的PBS緩沖液沖洗。滴加抗，37孵育30min，用0.1M的PBS緩沖液沖洗。滴加DAB顯色劑在室溫下顯色，蘇木素復(fù)染。 1.4 免疫組化染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用免疫組化染色結(jié)合圖像分析進(jìn)行。用低倍鏡和高倍鏡觀察切片，陽性細(xì)胞為鏡下組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞漿中存在粗細(xì)一致的棕黃色顆粒，染色明顯高于背景。見圖1，圖2。 圖像分析方法為：從每張免疫組化染色片中隨機(jī)選取5個(gè)視野，輸入TECBIAS-6803真彩色生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)

13、，測量平均光密度值和面積之乘積，以此反映MMP-3含量的變化。 1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS11.0版軟件進(jìn)行單因素多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析。 2 結(jié)果 見表1。表1 MMP-3與TIMP-1在組織中的表達(dá)（略）注：MMP-3的含量：各組與正常對照組比較，P0.01；與術(shù)后2天組比較，aP0.01 ，aaaP0.01；與術(shù)后7天組比較，aaP0.01。TIMP-1的含量：各組與正常對照組比較，P0.01；與術(shù)后2天組比較，bP0.01 ，bbbP0.01；與術(shù)后7天組比較，bbP0.05 3 討論 3.1 MMP-3及TIMP-1

14、的生物學(xué)特性 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是近年來細(xì)胞分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容，位于上皮或內(nèi)皮細(xì)胞下層、結(jié)締組織周圍的物質(zhì)，包括基底膜和間質(zhì)性結(jié)締組織。其成分大體分為膠原、蛋白聚糖和糖蛋白?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是由成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及結(jié)締組織細(xì)胞等產(chǎn)生的一組在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性，能降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)成分的酶。主要參與組織的重建與修復(fù)、傷口愈合、炎癥反應(yīng)等5。根據(jù)其作用的底物不同，基質(zhì)金屬蛋白酶主要分為膠原酶（MMP-1、MMP-8、MMP-13)、基質(zhì)溶解素（MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11）、明膠酶（MMP-2、MMP

15、-9）等亞家族 ?；|(zhì)金屬蛋白酶-3廣泛存在于多種組織及細(xì)胞中，MMP-3降解底物為蛋白聚糖、明膠、V、型膠原等6。組織金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）是一種M為58000的糖蛋白，是基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3的特異性抑制劑，在正常情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶和組織金屬蛋白酶抑制劑之間存在著一種精細(xì)的平衡，組織金屬蛋白酶抑制劑可以通過其氨基酸末端決定簇與基質(zhì)金屬蛋白酶按1：1的比例結(jié)合，從而阻斷后者的活性，因此，它是組織局部基質(zhì)金屬蛋白酶活性最重要的調(diào)節(jié)因素7 。 3.2 MMP-3、TIMP-1與腸粘連的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)，腹膜間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和各種腹腔臟器的漿膜組織中，存在MMPs和TIMPs

16、的活性表達(dá)，提示這是一個(gè)部分影響腹膜組織修復(fù)和粘連形成的因素8。而且，大多數(shù)MMPs的表達(dá)是由細(xì)胞因子、激素、生長因子及細(xì)胞轉(zhuǎn)化來轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的。其中腫瘤壞死因子-（TNF-）上調(diào)MMP-3的表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-）下調(diào)MMP-3的表達(dá)9。 腫瘤壞死因子-（TNF-）和轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-）是腹腔粘連中起主要作用的細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子-（TNF-）的主要作用是介導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子，在體內(nèi)炎癥前期有一定的介導(dǎo)作用；轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-）是啟動和終止組織修復(fù)的主要細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)損傷組織重建的全過程10。這一結(jié)果提示在損傷早期，腫瘤壞死因子-起主要作用；而在損傷組織重建時(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子-

17、起主要作用。因此，在損傷早期，腫瘤壞死因子-上調(diào)MMP-3的表達(dá)，使MMP-3含量升高，MMP-3降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原，減少粘連形成，因此在損傷早期較少有粘連形成。以后隨著組織重建的啟動，轉(zhuǎn)化生長因子-逐漸起主要作用，下調(diào)MMP-3的表達(dá)，上調(diào)TIMP-1的表達(dá)8，使MMP-3的含量逐漸降低，因而，細(xì)胞外基質(zhì)的膠原不能被分解而永久沉積下來形成粘連。 本實(shí)驗(yàn)顯示，MMP-3從組織損傷至腸粘連形成過程中經(jīng)歷了一個(gè)由升高到逐漸下降的過程，峰值在術(shù)后2天；TIMP-1則持續(xù)升高，峰值在術(shù)后7天,術(shù)后14天組較峰值略為降低。各組間兩兩比較，差異有顯著性（P0.01）。提示MMP-3、TIMP-1的含量與

18、腸粘連密切相關(guān)。 術(shù)后2天組MMP-3和TIMP-1在組織中的含量高于正常對照組，差異有顯著性（P0.01）。此時(shí)，由于介導(dǎo)炎癥的細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-（TNF-）起主要作用，上調(diào)MMP-3的表達(dá)，使MMP-3的含量升高；可能早期的組織損傷改變了MMPs 和 TIMPs的表達(dá)，TIMP-1的含量同步升高，以達(dá)到抑制MMP-3表達(dá)的作用。由于大量MMP-3不能被及時(shí)抑制，它分解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原，此時(shí)粘連形成較輕。此時(shí)，MMP-3/ TIMP-11：1，基本與正常對照組比例相同，在一個(gè)正常范圍內(nèi)，在此階段，無粘連形成或粘連形成輕。 術(shù)后7天組，組織中MMP-3含量降低，而TIMP1的含量升高至峰值

19、，與術(shù)后2天組相比，差異有顯著性（P值均小于0.01）。術(shù)后7天，隨著組織重建的啟動，腫瘤壞死因子-的作用逐漸弱化，轉(zhuǎn)化生長因子-逐漸起主要作用，轉(zhuǎn)化生長因子-下調(diào)MMP-3的表達(dá)，上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，使MMP-3的含量逐漸降低，TIMP-1的含量達(dá)峰值，由于TIMP-1對MMP-3表達(dá)的抑制作用，TIMP-1進(jìn)一步抑制MMP-3的表達(dá)，MMP-3降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原量減少，粘連加重，此時(shí)MMP-3/ TIMP-11：1.72，腸粘連較術(shù)后2天組加重。 術(shù)后14天組，隨著組織愈合的繼續(xù)，轉(zhuǎn)化生長因子-繼續(xù)起主要作用，組織中MMP-3含量繼續(xù)降低，此時(shí)，不再需要更多的TIMP-1抑制MMP-

20、3的表達(dá)，TIMP-1的含量下降，與術(shù)后7天組相比，MMP-3和TIMP-1的含量差異有顯著性（P值分別小于0.01和0.05）。此時(shí)，MMP-3/ TIMP-11：2，TIMP-1的含量是MMP-3含量的2倍，使MMP-3的作用趨于靜止，不能降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原，形成穩(wěn)定粘連。同樣，術(shù)后14天組和術(shù)后2天組相比差異有顯著性（P值均小于0.01）。說明兩組間腸粘連的程度不同，根據(jù)兩組間MMP-3含量及TIMP-1的含量的變化，能夠得出術(shù)后14天組腸粘連程度較重的結(jié)論。 因此，本研究提示，MMP-3、TIMP-1在手術(shù)后不同時(shí)期的不同表達(dá)可能在腸粘連的形成中發(fā)揮一定作用。在手術(shù)中和手術(shù)后初期進(jìn)行

21、臨床干預(yù)是預(yù)防腸粘連的最佳時(shí)期， MMPs和TIMPs的活性表達(dá)是一個(gè)部分影響腹膜組織修復(fù)和粘連形成的因素，有可能為預(yù)防術(shù)后腸粘連的形成提供新的靶點(diǎn)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Bolcato Bellemin AL,Elkaim R,Abehsera A,et al.Expression of mRNAs encoding for alpha and beta integrin subunits,MMPs,and TIMPs in stretched human periodontal ligament and gingival fibroblasts.J Dent Res，2000，79(9):17

22、12-1716.2 尚曉濱，吳咸中，李東華,等.活血化瘀中藥對清解通下中藥增效作用的實(shí)驗(yàn)研究-對粘連組織中MMP-1和TIMP-1影響的實(shí)驗(yàn)研究.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2006,12（4）:385-388.3 Arumugam S,Jang YC,Chen Jensen C,et al.Temporal activity of plasminogen activity of plasminogen activators and martrix metalloproteinases during cutaneous wound repair.Surgery,1999,125(6):587-593.4 文亮，屈紀(jì)富，劉明華.基質(zhì)金屬蛋白酶3在創(chuàng)傷愈合中作用的實(shí)驗(yàn)研究.世界急危重病醫(yī)學(xué)雜志,2007,4（2）：1751-1754.5 湯田鳳，梁清華痹腫消湯對活動期