慢性哮喘小鼠EGFR的表達(dá)及地塞米松對(duì)其的影響

1、慢性哮喘小鼠EGFR的表達(dá)及地塞米松對(duì)其的影響【關(guān)鍵詞】 哮喘Expression of epidermal growth factor receptor and its ligands in chronic asthma mice and the influence of dexamethasone【Abstract】 AIM: To investigate the effect of epidermal growth factor receptor (EGFR) system on the asthmatic airway remodeling.METHODS: The chronic a

2、sthma mice model was established by ovalbumin (OVA) immunization. Mice were injected intraperitoneally with dexamethasone of 2 mg/kg 1 h before the sensitization and sacrificed by cervical dislocation 24 h after the last challenge. Conventional pathological slides were also observed to study the pul

3、monary inflammation and the thickness of airway wall and airway smooth muscles. The concentration of TGF in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was detected by ELISA. RTPCR was conducted to detect the mRNA expression of EGFR in the lungs. Pulmonary EGFR protein was observed by immunohistochemical st

4、aining and Western blot analysis. RESULTS: In chronic asthma mice, inflammatory cell infiltration around bronchi and vessels could been seen on slides. The airway wall and the airway smooth muscles thickened and TGF in BALF increased. The expression of EGFR mRNA and protein in the lungs increased (P

5、<0.01). Dexamethasone injection before sensitization decreased TGF in BALF and the expression of phosphoEGF receptor protein in the lung alleviated the pulmonary inflammation and inhibited the thickening of airway wall and airway smooth muscle (P<0.01). CONCLUSION: Airway remodeling oc

6、curs in the chronic mice asthma model. Early dexamethasone injection can inhibit the expression and activation of EGFR system, decrease the TGF concentration in BALF and prevent the airway remodeling.【Keywords】 asthma; airway remodeling; receptor, epidermal growth factor; transforming growth factor

7、alpha; dexamethasone【摘要】 目的： 探討表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在慢性哮喘氣道重建中的作用. 方法： 建立小鼠慢性哮喘模型，致敏前1 h氣道內(nèi)滴入地塞米松2 mg/kg，最后一次激發(fā)24 h后處死動(dòng)物，常規(guī)病理切片觀察小鼠肺內(nèi)炎癥情況、氣管壁厚度及氣道平滑肌厚度，ELISA法測(cè)定肺泡灌洗液中TGF的濃度，RTPCR觀察小鼠肺部EGFR mRNA的表達(dá)，免疫組化及Western Blot觀察EGFR蛋白的表達(dá). 結(jié)果： 慢性哮喘組小鼠氣道支氣管及血管周圍大量炎癥細(xì)胞聚集、氣管壁及氣道平滑肌增厚、肺泡灌洗液中TGF濃度增高，肺組織EGFR mRNA及EGFR蛋白的表達(dá)增高

8、(P<0.01). 哮喘小鼠致敏前使用地塞米松可減輕氣道炎癥，減少氣管壁及氣道平滑肌的增厚，肺泡灌洗液中TGF濃度、肺組織磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)較慢性哮喘組均有所下降(P<0.01). 結(jié)論： 慢性哮喘小鼠出現(xiàn)氣道重建，早期使用地塞米松可以預(yù)防氣道重建，降低BALF中TGF的濃度、抑制肺組織EGFR的表達(dá)和活化.【關(guān)鍵詞】 哮喘；氣道重建；受體，表皮生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子；地塞米松0引言氣道重建是哮喘的特征性病理改變，成為頑固性哮喘的病理基礎(chǔ)，直接影響治療效果，是目前哮喘研究的熱點(diǎn)問題之一. 我們建立了小鼠慢性哮喘模型，觀察了慢性哮喘小鼠氣道重建情況、表皮生長(zhǎng)因子

9、受體（epidermal gronth factor receptor, EGFR）和其配體表達(dá)的變化及地塞米松對(duì)其的影響，旨在探究EGFR系統(tǒng)在慢性哮喘氣道重建中的作用.1材料和方法11材料6周齡雌性BALB/C小鼠40只，體質(zhì)量2025 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供；UV1000紫外分光光度計(jì)（英國(guó)Cambridge公司）；DYA型電泳儀（上海生化所申華生化技術(shù)開發(fā)公司）；PCR擴(kuò)增儀（GeneAmpPCRsystem 9600 PERKIN ELIMER）； FLUORSTM Multimager多功能圖像分析儀（BioRAD）；Leica Q500 MC圖像分析系統(tǒng)（德國(guó)）

10、；卵白蛋白干粉（Grade）（美國(guó)Sigma公司）；氫氧化鋁（上海生物制品有限公司）；地塞米松磷酸鈉注射液（天津市氨基酸公司人民制藥廠）；小鼠TGF ELISA試劑盒（上海生物晶美公司）；Trizol（Gibcol BRL公司）；One Step RNA PCR Kit （TaKaRa公司）；EGFR mAb（Cell Signaling Technology）；磷酸化EGFR mAb（Cell Signaling Technology）.12方法121動(dòng)物模型及分組健康BALB/C小鼠40只，隨機(jī)等分為4組，每組10只，A組為正常對(duì)照組，B組為慢性哮喘組，C組為地塞米松處理組，D組為生理鹽水

11、處理組. 置于相對(duì)清潔恒溫環(huán)境. 予以標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由取水. 參照文獻(xiàn)1制備動(dòng)物模型，將OVA 20 g加2.6 mg氫氧化鋁溶于pH為7.4的PBS 0.2 mL中，于第0, 7, 14日給B組、C組、D組小鼠腹腔注射，A組小鼠腹腔注射0.2 mL PBS；于第2029, 47, 61, 7375日鼻腔內(nèi)滴入OVA抗原液50 L（含OVA 100 g），A組小鼠鼻腔內(nèi)滴入PBS 50 L；C組小鼠每次滴入OVA前1 h腹腔注射地塞米松0.2 mL（50 g），D組小鼠每次滴入OVA前1 h腹腔注射PBS 0.2 mL. 小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌痙攣為陽性反應(yīng). 最后一次激發(fā)24 h后頸

12、椎脫臼處死動(dòng)物.122BALF中TGF的檢測(cè)按照ELISA檢測(cè)試劑盒操作流程檢測(cè)各組小鼠BALF中TGF含量.123肺組織EGFR mRNA的測(cè)定根據(jù)One Step RNA PCR Kit試劑盒說明書，用半定量RTPCR法測(cè)定各組小鼠肺組織EGFR mRNA. EGFR引物序列(擴(kuò)增片段長(zhǎng)499 bp)： 上游引物5AGAAGATGGCATCCGCAAGT3；下游引物5ATTGGG TGTCCCGAAGAGTT3. GAPDH引物序列(擴(kuò)增片段長(zhǎng)306 bp)： 上游引物5 cctgcatccactggtgctgc3；下游引物5 CTTGACAAAGTTGTCATTGA3.124Wester

13、n blot印跡測(cè)定測(cè)定肺組織EGFR蛋白及磷酸化EGFR蛋白表達(dá).125肺組織病理變化處死動(dòng)物后，取肺組織置于60 g/L固定24 h，常規(guī)制備病理切片，HE染色后觀察肺組織病理變化. 結(jié)果為細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞質(zhì)呈淡紅色. 參照文獻(xiàn)2關(guān)于氣道各層的定義，采用德國(guó)Leica Q500 MC圖像分析系統(tǒng)，測(cè)定不含軟骨的完整氣管橫斷面，分別以WAt/ Pbm， WAi/ Pbm， WAm/ Pbm表示氣管總管壁厚度、內(nèi)壁厚度及氣道平滑肌厚度.12.6小鼠肺組織EGFR免疫組織化學(xué)染色采用LSAB法. 處死小鼠后，取每只小鼠肺門支氣管組織行免疫組織化學(xué)染色，隨機(jī)計(jì)數(shù)50個(gè)支氣管平滑肌細(xì)胞（每組共計(jì)數(shù)

14、500個(gè)），結(jié)果判定：-為無棕色顆粒沉淀或棕色顆粒少量、稀疏；為細(xì)胞膜區(qū)域出現(xiàn)淡黃色顆粒沉淀；為細(xì)胞膜區(qū)域出現(xiàn)黃色顆粒沉淀；為細(xì)胞膜區(qū)域出現(xiàn)棕色顆粒沉淀.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 計(jì)量資料以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，表1資料組間比較采用Kruskal Wallis檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，免疫組化結(jié)果排成列聯(lián)表，進(jìn)行2檢驗(yàn).2結(jié)果21慢性哮喘小鼠肺組織病理變化及地塞米松的干預(yù)哮喘小鼠可見上皮細(xì)胞破壞,支氣管、血管周圍大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主，地塞米松處理組炎癥減輕，生理鹽水處理組無變化. 圖像分析顯示，哮喘組小鼠氣道壁、內(nèi)壁、氣道平滑肌層均增厚；地塞米松處理組

15、小鼠氣道壁總厚度、內(nèi)壁、氣道平滑肌層厚度明顯薄于慢性哮喘組小鼠（P<0.01,表1）,與正常對(duì)照組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生理鹽水處理組與慢性哮喘組相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.表1各組小鼠氣道形態(tài)學(xué)參數(shù)比較 (略)22慢性哮喘小鼠肺組織EGFR mRNA, EGFR蛋白、磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)及地塞米松對(duì)其的影響慢性哮喘小鼠肺組織EGFR mRNA, EGFR蛋白、磷酸化EGFR蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加（P<0.01）；地塞米松處理組小鼠肺組織EGFR mRNA, EGFR蛋白表達(dá)與慢性哮喘組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；地塞米松處理組小鼠肺組織磷酸化EGFR蛋白的表

16、達(dá)較慢性哮喘組下降（P<0.01，圖1，2，表2）.表2各組小鼠肺組織EGFR mRNA相對(duì)量比較(略)2.3各組小鼠肺組織免疫組化正常對(duì)照組小鼠氣道黏膜上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞可見較弱的磷酸化EGFR表達(dá). 慢性哮喘組磷酸化EGFR陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，主要表達(dá)于氣道黏膜上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞. 地塞米松處理組陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯低于慢性哮喘組（P<0.01,表3）.表3各組小鼠磷酸化EGFR免疫組化結(jié)果（略）24慢性哮喘小鼠BALF中TGF含量變化及地塞米松的干預(yù)慢性哮喘小鼠BALF中TGF含量（0.764±0.065）

17、 ng/L明顯高于正常對(duì)照組（0.259±0.032） ng/L （P<0.01）. 地塞米松處理組小鼠BALF中TGF含量（0.282±0.024） ng/L明顯低于慢性哮喘組（P<0.01），而與正常對(duì)照組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.3討論支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的慢性疾病. 通過大量病理學(xué)的研究證明，慢性氣道炎癥和氣道重建是哮喘的兩個(gè)主要病理學(xué)特征3 ，其中氣道重建倍受學(xué)者關(guān)注. 氣道重建包括支氣管上皮脫落、杯狀細(xì)胞肥大、基底膜增厚及黏膜下組織和平滑肌增生、肥大，與臨床癥狀、肺功能、氣道高反應(yīng)性密切相關(guān)4,因此研究哮喘氣道重建及其防治措

18、施具有重要意義.氣道重建的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，許多研究5均表明炎癥細(xì)胞、炎癥因子及可溶性生長(zhǎng)因子等在其中發(fā)揮重要作用，但引起氣道重建的各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子以及信號(hào)的傳遞通路尚未完全明確，在進(jìn)一步的研究過程中. 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growht factor, EGF）和EGFR在氣道重建和修復(fù)中也起重要作用6. EGFR是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并克隆的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK），是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和存活的重要調(diào)節(jié)因子. 近年來對(duì)EGFR的研究取得了一些重要進(jìn)展，其所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)效應(yīng)具有多向性，包括增殖、遷移、細(xì)胞分化和內(nèi)環(huán)境的

19、穩(wěn)定等，并與細(xì)胞的再生和惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān). EGFR包括膜外區(qū)、跨膜區(qū)、膜內(nèi)區(qū)3個(gè)部分. 當(dāng)配體與受體的胞外區(qū)結(jié)合后，受體胞內(nèi)部分的酪氨酸殘基磷酸化，形成酪氨酸底物結(jié)合位點(diǎn)，使EGFR激活，再通過識(shí)別一系列底物酶將外界信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)DNA合成及細(xì)胞增殖效應(yīng)7-10.我們通過對(duì)小鼠哮喘模型各組的研究，證實(shí)了卵蛋白的長(zhǎng)期吸入可誘發(fā)氣道重建，包括氣管壁和氣道平滑肌層的增厚，肺組織EGFR mRNA, EGFR蛋白和磷酸化EGFR蛋白及氣道平滑肌磷酸化EGFR表達(dá)增強(qiáng)，BALF中EGFR配體TGF濃度增高. 因此推測(cè)與細(xì)胞分化、增殖密切相關(guān)的EGFR系統(tǒng)可能與氣道重建有一定關(guān)系.

20、哮喘時(shí)氣道分泌炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及慢性炎癥導(dǎo)致氣道損傷，引起EGFR系統(tǒng)活化，參與氣道修復(fù)，而過多的修復(fù)引起氣道壁和氣道平滑肌層增厚. 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，激發(fā)前使用地塞米松可以有效地預(yù)防氣道重建. 糖皮質(zhì)激素是目前首選的控制氣道炎癥及防止氣道重建的藥物. 許多研究表明應(yīng)用皮質(zhì)激素可有效地改善肺功能和氣道阻塞. 但是，目前對(duì)皮質(zhì)激素在氣道重建中的作用機(jī)制了解較少. 研究發(fā)現(xiàn)地塞米松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍可抑制體外培養(yǎng)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖，地塞米松還可抑制凝血酶，胎牛血清，EGF, bFGF對(duì)氣道平滑肌的促有絲分裂11-14. 本研究發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)肺組織EGFR mRNA, EGF

21、R蛋白表達(dá)無影響，但可降低BALF中TGF濃度，減少肺組織及氣道平滑肌磷酸化EGFR蛋白表達(dá). 推測(cè)地塞米松預(yù)防氣道重建可能存在的機(jī)制： 通過抑制炎癥反應(yīng)，有效地預(yù)防氣道重建. 通過抑制炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子（如TGF）的分泌，抑制EGFR系統(tǒng)活化，預(yù)防氣道重建.【參考文獻(xiàn)】1 Henderson WR, Tang LO, Chu SJ, et al. A role for cysteinyl leukotrienes in airway remodeling in a mouse asthma model J. Am J Respir Crit Care Med, 2002,165(1

22、):108-116.2 James AL, Hogg JC, Dunn LA, et al. The use of the internal perimeter to compare airway size and to calculate smooth muscle shortening J. Am Rev Respir Dis, 1988,138:136-139.3 Fahy JV, Corry DB, Boushey HA. Airway inflammation and remodeling in asthmaJ. Curr Opin Pulm Med, 2000,6(1):15-20

23、.4 Davies DE, Wicks J, Powell RM, et al. Airway remodeling in asthma: New insights J. J Allergy Clin Immunol, 2003,111(2):215-225.5 Hamid Q. Airway remodeling in asthmaJ. J Allergy Clin Immunol, 2003,111(6):1420-1421.6 Davies DE, Polosa R, Puddicombe SM, et al. The epidermal growth factor receptor a

24、nd its ligand family: Their potential role in repair and remodelling in asthma J. Allergy, 1999,54:771-783.7Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, et al. The ErbB signaling network:receptor heterodimerization in development and cancer J. EMBO J, 2000,19(13):3159-3167.8 Lu Z, Jiang G, BlumeJensen P, et al. E

25、pidermal growth factorinduced tumor cell invasion and metastasis initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase J. Mol Cell Biol, 2001,21(12):4016-4031.9 Johannessen LE, Ringerike T, Molnes J, et al. Epidermal growth factor receptor efficiently activates mitogenactivated protein kinase in HeLa cells and Hep2 cells conditionally defective in clathrindependent endocytosis J. Exp Cell Res, 2000,260(1):136-145.10 Denning M