QC-FF-0039 微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、 -微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件編號(hào)：QC-FF-0039版本號(hào)：00第 29 頁(yè) 共 29 頁(yè)目的：建立微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程范圍：本規(guī)范適用于微生物限度檢查法檢查職責(zé)：質(zhì)量控制部全體人員內(nèi)容：第一部分：綜述1.簡(jiǎn)述細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)是檢測(cè)非規(guī)定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是評(píng)價(jià)生產(chǎn)企業(yè)的藥用原料、輔料、設(shè)備、器具、工藝流程、環(huán)境和操作者衛(wèi)生狀況的重要手段和依據(jù)。細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外均采用平板菌落計(jì)數(shù)法，這是活菌計(jì)數(shù)的方法之一，也是目前國(guó)際上常用的一種方法。以瓊脂平板上的細(xì)菌、霉菌或酵母菌形成的一個(gè)獨(dú)立可見(jiàn)的菌落為計(jì)數(shù)依據(jù)。該法測(cè)定結(jié)果只反映在規(guī)定

2、條件下所生長(zhǎng)的細(xì)菌（嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)，不包括對(duì)營(yíng)養(yǎng)、氧氣、溫度、PH和其他因素有特殊要求的細(xì)菌、霉菌和酵母菌。一個(gè)細(xì)菌、霉菌或酵母菌的菌落均可由一個(gè)或多個(gè)菌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成。因此供試品中所測(cè)得的菌落數(shù)，實(shí)際為菌落形成單位數(shù)，不應(yīng)理解為細(xì)菌、霉菌、酵母菌的個(gè)數(shù)。在進(jìn)行本法測(cè)定時(shí)，必須嚴(yán)格按本法所規(guī)定的條件操作，以免產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)誤差。2.設(shè)備與儀器2.1設(shè)備2.1.1無(wú)菌室 微生物限度檢查應(yīng)有單獨(dú)的無(wú)菌室，每個(gè)無(wú)菌室應(yīng)有獨(dú)立的凈化空氣系統(tǒng)。2.1.1.1結(jié)構(gòu)和要求見(jiàn)中國(guó)藥典二部無(wú)菌檢查法2.1.1.2操作間 操作間應(yīng)安裝空氣除菌過(guò)濾層流裝置。環(huán)境潔凈度不應(yīng)低于10000

3、級(jí)，局部潔凈度為100級(jí)（或放置同等級(jí)凈化工作臺(tái)）。操作間或凈化工作臺(tái)的潔凈空氣應(yīng)保持對(duì)環(huán)境形成正壓，不低于4.9Pa。操作臺(tái)上備有電子天平，乙醇燈，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳頭等。2.1.1.3緩沖間 緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，無(wú)菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不得放置培養(yǎng)箱和其他雜物。2.1.1.4潔凈級(jí)別及檢查方法 通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降菌數(shù)測(cè)定法（參照醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。沉降菌數(shù)測(cè)定（ 法）無(wú)菌室操作臺(tái)消毒擦拭后，先啟動(dòng)層流凈化裝置30min，將備妥的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板3個(gè)（經(jīng)30-35預(yù)培養(yǎng)48h，證明無(wú)菌落生長(zhǎng)），以無(wú)

4、菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈化臺(tái)左、中、右各1個(gè)，開(kāi)蓋，暴露30min后將蓋蓋上。在30-35培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置培養(yǎng)48h,取出檢查。 3個(gè)平板生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)不超過(guò)1個(gè)。2.1.1.5在每次操作前、后，用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液擦拭操作臺(tái)及可能污染的死角。然后啟動(dòng)層流凈化裝置，同時(shí)用紫外殺菌燈照射30min。2.1.2陽(yáng)性菌試驗(yàn)應(yīng)另設(shè)單獨(dú)的凈化工作臺(tái)，不得在供試品檢驗(yàn)用的無(wú)菌室內(nèi)或凈化工作臺(tái)上操作。2.1.3無(wú)菌室與洗刷、滅菌消毒、培養(yǎng)、結(jié)果觀察及辦公間等配套設(shè)施應(yīng)相對(duì)集中，布局合理，避免污染，便于管理。2.2儀器2.2.1恒溫培養(yǎng)箱（30-35）、生化培養(yǎng)箱（20-25）、微波

5、爐、勻漿儀（3000-8000r/min）或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱（250-300）、電冰箱、離心機(jī)、離心管、0.45m濾膜及薄膜過(guò)濾器、蒸汽滅菌器（使用時(shí)要進(jìn)行生物指示劑滅菌效果檢查并應(yīng)定期請(qǐng)有關(guān)部門檢定）。菌落計(jì)數(shù)器、顯微鏡（1500x）、電子天平或天平（感量0.1g）， 系列比色計(jì)。2.2.2玻璃器皿錐形瓶（250-300ml,，內(nèi)裝玻璃珠若干；500ml，1000ml）、培養(yǎng)皿(直徑9cm）、量筒（100ml，500ml）、試管（18mm×18mm、28mm×198mm ）及塞、吸管(1ml分度0.01，10ml分度0.1）、注射器（20ml或30ml等）

6、、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）、不銹鋼桶（帶蓋）。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒不掛水滴，無(wú)殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距處塞入約2cm適宜疏松的棉花，置吸管筒內(nèi)或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應(yīng)加硅膠塞或棉塞，若用振蕩器制備混懸液時(shí)，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時(shí)供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于高壓蒸汽121滅菌30min，烘干或160干熱滅菌2h，備用。2.2.3用具大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%-75%乙醇溶液浸泡）。無(wú)菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴(yán)）滅菌，備用也可用一次性無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。接種環(huán)（白銥金或鎳

7、鉻合金，環(huán)徑4-5mm、長(zhǎng)度6-10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號(hào)筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實(shí)驗(yàn)記錄紙等。3.試液、稀釋劑和試劑3.1試液3.1.1 0.1%苯扎溴銨溶液或其它適宜消毒液（供洗手、擦拭操作臺(tái)面用）。3.1.2 5%石碳酸溶液或其他適宜消毒液（配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用）。3.1.3 75%乙醇溶液。3.1.4 碘酊或碘伏溶液。3.2稀釋劑和試劑稀釋劑配制后，高壓蒸汽滅菌法滅菌。3.2.1 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。3.2.2 PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液。3.

8、2.3 無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉溶液。3.2.4 PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液。3.2.5 PH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液按藥典附錄 配制后，過(guò)濾，分裝，滅菌。3.2.6 0.1%無(wú)菌氯化三苯四氮唑溶液（TTC）。3.2.7 PH7.2無(wú)菌磷酸鹽緩沖液。4.培養(yǎng)基4.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.2培養(yǎng)基制備注意事項(xiàng)：采用干燥培養(yǎng)基，按說(shuō)明配制，應(yīng)對(duì)滅菌后的培養(yǎng)基PH值進(jìn)行校驗(yàn)。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選，瓊脂凝固力應(yīng)測(cè)定，以確定配制時(shí)瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純以上。4.3配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀。如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過(guò)濾，滅菌后使用。4.4培養(yǎng)基的分裝量

9、不得超過(guò)容器的2/3，以免滅菌時(shí)溢出。包裝時(shí)，塞子必須塞緊，以免松動(dòng)或脫落造成染菌。4.5培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細(xì)菌繁殖。4.6滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25，防止被污染，可在三周內(nèi)用畢；保存于密閉容器中，可在一年內(nèi)使用。制備好的培養(yǎng)基放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免水分散失及染菌。4.7用水浴或微波爐加熱溶化瓊脂培養(yǎng)基，勿用電爐直接溶化瓊脂培養(yǎng)基，以免營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)度受熱而破壞。已溶化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，剩余培養(yǎng)基不宜再用。培養(yǎng)基不能反復(fù)加熱溶化。5.供試品抽樣、保存及檢驗(yàn)量5.1抽樣5.1.1一般采用隨機(jī)抽樣方法，其抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝單位）的3-5倍量（以備復(fù)試或留樣觀察）。

10、5.1.2抽樣時(shí)，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠?，應(yīng)選取有疑問(wèn)的樣品。機(jī)械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。5.1.3凡藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀長(zhǎng)螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無(wú)需再抽樣檢驗(yàn)。5.2保存5.2.1供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)的污染菌因保存條件不妥導(dǎo)致死亡，損傷或繁殖。5.2.2供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開(kāi)啟。包裝已開(kāi)啟的樣品不得作為供試品。5.3檢驗(yàn)量5.3.1所有劑型的檢驗(yàn)量均需取自2個(gè)以上包裝單位（中藥蜜丸需取自4丸、膜劑取4片以上）。5.3.2固體及半固體（黏稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10g。5.3.

11、4液體制劑檢驗(yàn)量為10ml。5.3.4膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗(yàn)量為25cm2（中藥膜劑較厚，不宜取量過(guò)多），化學(xué)藥及生化藥膜劑檢驗(yàn)量為50cm2 。5.3.5特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3g ，液體制劑采用原液者不得少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。5.3.6要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加10g或10ml。5.3.7包裝材料，除另有規(guī)定外其檢驗(yàn)量20 cm2。6.試驗(yàn)準(zhǔn)備6.1將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管、量筒、稀釋劑等經(jīng)傳遞窗移至無(wú)菌室內(nèi)。每次試驗(yàn)所用物品必須事先做好計(jì)劃，準(zhǔn)備足夠

12、用量，避免操作中出入無(wú)菌間。編號(hào)后將全部外包裝（牛皮紙）去掉。6.2.開(kāi)啟無(wú)菌室紫外殺菌燈和空氣過(guò)濾裝置，并使其工作不低于30min。6.3關(guān)閉紫外殺菌燈后，操作人員用肥皂洗手，進(jìn)入緩沖間，換工作鞋。再用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無(wú)菌衣、帽、口罩、手套。6.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭供試品瓶、盒、袋等的開(kāi)口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或剪將供試品啟封。7.供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。如使用了乳化劑、分散劑、中和劑或滅活劑，其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)和存活無(wú)影響性。供試液的制備

13、若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過(guò)45 ，30min。除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法如下：7.1液體供試品 取供試品10ml，加 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無(wú)菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加0.9%無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml ?？扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。7.2固體、半固體或黏稠液供試品 取供試品 ，加0.9%無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的無(wú)菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。蜜丸等需剪碎，放入勻漿杯。7.3非水溶性供試品軟膏、乳膏劑

14、先將已備妥滅菌的含司盤 、單硬脂酸甘油脂 、聚山梨脂80的混合物融化，待冷至45時(shí)，加入供試品5g（或5ml），立即用玻棒攪拌均勻，分次少量慢慢加入45的PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20供試液。7.3.2油劑 取供試品10ml，加入無(wú)菌聚山梨酯 ，搖勻，再加入0.9%無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100ml7.3.3栓劑 稱取供試品10g ，置滅菌錐形瓶中，加適量PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，置45水浴保溫10min，使溶，加入無(wú)菌聚山梨酯80，振搖使之乳化，再加PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（稀釋劑和聚山梨酯80總量為100ml ），搖勻。

15、7.3.4眼膏劑 取供試品10g，加至含20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯（制法選用孔徑為0.22m)的脂溶性濾膜，以薄膜過(guò)濾法過(guò)濾除菌。濾器在140干熱滅菌2小時(shí)，然后加入45的PH7.0 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100，振搖5-10min，萃取，待油水明顯分層，取其水層作為供試液。7.4非水溶性膜劑供試品 化學(xué)藥膜劑一般取樣為100cm2，置滅菌錐形瓶中，加入適量的PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，于45水浴中保溫，浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。中藥膜劑取，剪碎，加適量的PH7.0 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（通常加1ml或2ml ），浸泡，振搖，以供試品浸液作為供試液。7.5腸溶及結(jié)腸溶制劑供試

16、品 取供試品10g，腸溶制劑加PH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，結(jié)腸溶制劑加PH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液至100ml，均置45水浴中，振搖，使溶解，作為供試液。7.6氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供試品，置冰箱冰凍室內(nèi)約1h 。取出，速消毒供試品容器的開(kāi)啟部位周圍，用無(wú)菌鋼錐在容器上消毒部位鉆一小孔，在室溫輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，加至適量的PH7.0氯化鈉無(wú)菌蛋白胨緩沖液（若含非水溶性成分，加適量的無(wú)菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1:10的供試液。7.7茶劑 取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，振

17、搖2-3min，以滅菌紗布過(guò)濾（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1:10加稀釋劑，浸泡30min）以上供試品如吸水膨脹，或黏度過(guò)高，可增加稀釋劑的量，制成1:20-1:100供試液。7.8具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法如下：7.8.1稀釋法 取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測(cè)定菌數(shù)時(shí)，1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。7.8.2離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液， ，3000r/min離心20mi

18、n，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋劑至原規(guī)定量。如供試液中有不溶顆粒、沉淀，先以500r/min，離心5min，留離心沉淀物，取全部上清液按上述高速再離心，留底部集菌液約2ml，加稀釋劑至原規(guī)定量。7.8.3薄膜過(guò)濾法 見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù) 。7.8.4中和法 凡含汞、砷或防腐劑等的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化、中和其抑菌活性，制成供試液。7.9包裝材料供試品 取試樣用開(kāi)孔面積為20cm2的消毒過(guò)的金屬模板壓在內(nèi)層表面上，將無(wú)菌棉簽用氯化鈉注射液稍沾濕，在板孔范圍內(nèi)擦抹5次，換1支棉簽再擦抹5次，每個(gè)位置用2支棉簽共擦抹10次，共擦抹5個(gè)位置100 cm2。每支棉簽?zāi)ㄍ旰罅⒓醇魯啵?/p>

19、或燒斷），投入盛有30ml無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶（或大試管）中。全部擦抹棉簽投入瓶中后，將瓶迅速搖晃1分鐘，即得供試液。8.供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法）8.1取3-4支滅菌試管，分別加入9mlPH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液。加稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。8.2另取1支1ML滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml ，加入裝有9mlPH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液的試管中，（此時(shí)操作一般為左手執(zhí)試管并將塞打開(kāi)，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量。切勿在乙醇燈焰峰的正上方操作，以免燈焰將供試液中的菌細(xì)胞殺滅）混勻，即1:100； 供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:103、1:104 等適宜

20、稀釋級(jí)（3-4）。每遞增 稀釋級(jí)，必須另?yè)Q一支吸管。在作10倍遞增稀釋時(shí)，吸管插入第1級(jí)稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次。吸液時(shí)，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，貼于試管內(nèi)壁，調(diào)整液量至刻度，吸管移至第2級(jí)稀釋管的內(nèi)壁近液面處（勿接觸液面），緩慢地放出全部供試液（吸管內(nèi)應(yīng)無(wú)粘附或殘留液體），然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。9.計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證由于某些供試品具有抗菌活性，在建立測(cè)定方法或原測(cè)定法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須對(duì)供試品的抑菌活性及測(cè)定方法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)

21、行驗(yàn)證。9.1驗(yàn)證用菌株 大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，白色念珠菌，黑曲霉接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24-48h，黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含500-1000個(gè)cfu 的菌懸液。9.2驗(yàn)證方法 驗(yàn)證試驗(yàn)分四組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照組試驗(yàn)的菌回收率。9.2.1試驗(yàn)組 取最低稀釋級(jí)的供試液，按每1ml供試液加入50-100cfu試驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液

22、分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基；薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液2ml過(guò)濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。9.2.2菌液組 取上述試驗(yàn)菌液，測(cè)定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。9.2.3供試品對(duì)照組 取最低稀釋級(jí)的供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其所含菌數(shù)。9.2.4釋釋劑對(duì)照組 為考察供試液制備過(guò)程對(duì)微生物的影響程度，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試液，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml含50-100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。9.2.5試驗(yàn)組的菌回收率（%）=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組的平均菌落數(shù)×100%9.2.6稀釋劑對(duì)照組的

23、菌回收率（%）=稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)×100%9.3結(jié)果判定 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均應(yīng)不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70% ，則可按該供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌或酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。9.4驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌，霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。9.5注意事項(xiàng)9.5.1所用標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。以冷凍干燥的原始菌種開(kāi)啟后轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，其培養(yǎng)物為第一代。9.5.2黑曲霉菌的菌液制備將黑曲霉菌的孢子接種至真菌瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于20-25培養(yǎng)5-7天

24、，使大量的孢子產(chǎn)生。加入3-5ml的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，用無(wú)菌玻棒或接種環(huán)輕輕將孢子洗脫。然后，用一支10ml無(wú)菌球形毛細(xì)吸管，其管口用無(wú)菌棉花或紗布包扎且能過(guò)濾菌絲的裝置，吸出孢子菌液至無(wú)菌試管內(nèi)，用比濁法，將菌液稀釋至每毫升含10-100cfu。9.5.3做試驗(yàn)菌的回收率試驗(yàn)時(shí)，加入菌量以50-100cfu 為宜。加菌量過(guò)多，如薄膜法，菌落擁擠，則不好計(jì)數(shù)；加菌量過(guò)少，如小于30個(gè)，則誤差大。10.檢查法10.1平皿法10.1.1在上述進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，以該稀釋級(jí)吸管，吸取該稀釋級(jí)供試液各1ml至每個(gè)直徑90mm 的滅菌平皿中，或從高稀釋級(jí)至低稀釋級(jí)吸液時(shí)可用1支吸管吸供試液各

25、 至每個(gè)滅菌平皿中。每一稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少注2-3個(gè)平皿（一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開(kāi)，右手執(zhí)吸管），注皿時(shí)，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無(wú)殘留液體，防止反流到吸管尖端部。一般取適宜的連續(xù)2-3個(gè)稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定。10.1.2陰性對(duì)照 待各級(jí)稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管吸取稀釋劑（PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液）各1ml，分別注入4個(gè)平皿中。其中2個(gè)作細(xì)菌數(shù)陰性對(duì)照；另2個(gè)作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對(duì)照，如另用ypd瓊脂測(cè)定酵母菌數(shù)時(shí)，則再增加2個(gè)平皿作酵母菌數(shù)陰性對(duì)照。10.1.3傾注培養(yǎng)基：將預(yù)先配制好的細(xì)菌計(jì)數(shù)用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)用的

26、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（霉菌）和瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）溶化，冷至約45時(shí)，傾注上述各個(gè)平皿約15ml，以順時(shí)針或逆時(shí)針?lè)较蚩焖傩D(zhuǎn)平皿，使供試液或稀釋液與培養(yǎng)基混勻，置操作平臺(tái)上待凝。在旋轉(zhuǎn)平皿時(shí)切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上。10.1.4培養(yǎng)：一般細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于30-35 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于20-25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h。10.1.5菌落計(jì)數(shù)10.1.5.1一般將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。注意細(xì)菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落與供試品顆

27、粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的鑒別。必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。10.1.5.2供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌落排除，不可點(diǎn)計(jì)在細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)。排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。10.1.5.3供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后有時(shí)形成數(shù)量很多的有形物，且難與菌落相鑒別。為了有利于菌落計(jì)數(shù)，可在操作時(shí)將適宜稀釋級(jí)的供試液多增加注皿（1-2個(gè)平皿），注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱（勿結(jié)凍）中，在計(jì)數(shù)菌落時(shí)作為對(duì)照?；蛴?.001%TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后該培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落為紅

28、色，襯于白色背景上易于點(diǎn)計(jì)細(xì)菌菌落和區(qū)分其他有形物。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長(zhǎng)的菌落不易辨認(rèn)和點(diǎn)計(jì)，為防止這種情況，也可用0.001%TTC營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿。10.1.5.4若平板上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)；若平板生長(zhǎng)有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無(wú)明顯界線時(shí)，一條鏈、片作為一個(gè)菌落計(jì)，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀與鏈（片）狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，其外緣有若干性狀相似的單個(gè)菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。10.1.5.5若各稀釋級(jí)2個(gè)平板菌落的平均數(shù)在15以上，同稀釋級(jí)二平板菌落數(shù)

29、相差1倍時(shí)，該稀釋級(jí)菌落數(shù)不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)；當(dāng)2個(gè)平板菌落均數(shù)在15（含15）以下時(shí)，兩個(gè)平板菌落數(shù)的差值允許范圍為0-4,1-7,2-9,3-10,4-12,5-14,6-15,7-17,8-18,9-19,10-20.超出以上范圍即視為操作誤差，不得作為計(jì)數(shù)依據(jù)。10.1.5.6菌落生長(zhǎng)呈蔓延趨勢(shì)者，細(xì)菌，霉菌需逐日作初步點(diǎn)計(jì)，在點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的孢子散落在平板的其他部位，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差。10.1.5.7在48h點(diǎn)計(jì)細(xì)菌，120h點(diǎn)計(jì)霉菌時(shí)，如菌落極小，不易辨認(rèn)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天，再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。10.1.5.8對(duì)有疑議的供試品以

30、YDP培養(yǎng)基作酵母菌計(jì)數(shù)時(shí)，可培養(yǎng)至1周再點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。10.1.5.9含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)霉菌數(shù)，YDP瓊脂培養(yǎng)基點(diǎn)計(jì)酵母菌數(shù)。兩者計(jì)數(shù)值合并報(bào)告。10.1.5.10在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)有霉菌和酵母菌其數(shù)量多于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的霉菌和酵母菌，或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)多于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌數(shù)，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)報(bào)告結(jié)果。10.1.5菌數(shù)報(bào)告規(guī)則宜選取細(xì)菌、酵母菌平均菌落數(shù)在30-300之間、霉菌平均菌落數(shù)在30-100之間的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。10.1.6.1當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)

31、乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。10.1.6.2當(dāng)有2個(gè)相鄰稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值（比值=(高稀釋級(jí)平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù))/(低稀釋級(jí)平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)) 而定。若比值小于或等于2，以兩稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù)；若比值大于2但不超過(guò)5時(shí)，以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)；當(dāng)出現(xiàn)比值大于5，甚至高稀釋級(jí)的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證10.1.6.3當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均小于30，以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù).10.1.6.4如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，

32、或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以小于10報(bào)告菌數(shù)。10.2薄膜過(guò)濾法10.2.1取濾膜孔徑不大于0.45m，直徑不小于50mm可拆卸的濾器。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。使用時(shí)，必須保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。10.2.2水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，沖洗液、沖洗量及沖洗方法同方法驗(yàn)證試驗(yàn)。每片濾膜的總過(guò)濾量不

33、宜過(guò)大，以避免濾膜上的微生物受損傷。10.2.3每張濾膜取相當(dāng)于1g或1ml 供試品的供試液直接過(guò)濾，或加至適量稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。若供試品1g或1ml含菌較多，可選適宜稀釋級(jí)的供試液 ，過(guò)濾。用PH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊膽培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)。10.2.4陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋劑1ML同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。10.2.5培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

34、培養(yǎng)及菌落計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不多于100 個(gè)。如菌落數(shù)超過(guò)100個(gè)，不便計(jì)數(shù)時(shí)，可取高稀釋級(jí)的供試液同法操作，點(diǎn)計(jì)濾膜上的菌落數(shù)。10.2.6菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾1g或1ml供試品），或1 乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。10.3培養(yǎng)基稀釋法：取低稀釋級(jí)供試液（原液或1:10供試液）2份，每份各1ml，分別注入5個(gè)或5個(gè)以上平皿中（每皿0.2ml或0.2ml），每1個(gè)平皿傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液等量分注5個(gè)或 5個(gè)以上平板點(diǎn)計(jì)的菌落數(shù)之和，即為每1ml

35、的菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告。10.4結(jié)果報(bào)告10.4.1菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。10.4.2菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。10.5復(fù)試供試品細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任一項(xiàng)一次檢驗(yàn)不合格，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)重新取2倍包裝量的供試品，依法作單項(xiàng)復(fù)試兩次，以三次檢驗(yàn)結(jié)果的均值報(bào)告。若3次結(jié)果的平均值不超過(guò)該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；否則，判供試品不符合規(guī)定。11.注意事項(xiàng)11.1供試品檢驗(yàn)全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。使用滅菌用具時(shí)，不能接觸可能污染的任何器物，滅菌吸管不得用口吹吸。11.

36、2供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過(guò) 小時(shí)。否則，可能導(dǎo)致微生物繁殖或死亡而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。11.3供試液稀釋及注皿時(shí)應(yīng)振搖后取均勻的供試液，以免造成實(shí)驗(yàn)誤差。11.4為避免細(xì)菌菌落蔓延生長(zhǎng)，宜采取下列方法處理：11.4.1開(kāi)蓋干燥 將已凝固的瓊脂平板開(kāi)蓋，倒置斜放于凈化工作臺(tái)上，開(kāi)機(jī)后合蓋，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。11.4.2換陶瓦蓋 將已凝固的瓊脂平板蓋換上新近干熱滅菌的陶瓦蓋。11.4.3加TTC于傾注培養(yǎng)基前，在每1000ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂內(nèi)加入滅菌1%TTC溶液1ml（最終濃度為0.001%），混勻后傾注平皿。12.檢驗(yàn)報(bào)告書寫本品按中國(guó)藥典微生物限度檢查法檢驗(yàn)，結(jié)果符合或不符合規(guī)定。第二部分

37、：控制菌檢查1.方法驗(yàn)證在建立供試品的控制菌檢查法或原檢查法的檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，應(yīng)對(duì)供試品的抑菌活性及檢查法的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按各供試品微生物限度項(xiàng)下的規(guī)定（給藥途徑）選擇相應(yīng)的菌株，并按供試液的制備和控制菌檢查法所規(guī)定的方法進(jìn)行。2.儀器、設(shè)備及用具 見(jiàn)各控制菌檢查項(xiàng)下。3.試液、指示液 見(jiàn)各控制菌檢查項(xiàng)下。4.培養(yǎng)基 見(jiàn)各控制菌檢查項(xiàng)下。5.驗(yàn)證用菌株及菌液制備5.1菌種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌。5.2菌液制備 分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，各接種至5m

38、l營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1培養(yǎng)18-24h，取均勻培養(yǎng)物1ml用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10-100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對(duì)照試驗(yàn)的同時(shí)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成1ml含10-100cfu的菌液。6.供試液的制備見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7 。7.驗(yàn)證方法7.1試驗(yàn)組 取規(guī)定量供試液及10-100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中

39、，沖洗后，取出濾膜接種到增菌培養(yǎng)基中。7.2陰性對(duì)照組 設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌：驗(yàn)證銅綠單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。8結(jié)果判定 陰性對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法作該供試品的控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)參照細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.8具抑菌活性的供試品項(xiàng)下操作，以消除供試品的抑菌活性。建立新的方法，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。第三部分：大腸埃希菌檢查1簡(jiǎn)述

40、大腸埃希菌即大腸桿菌，為腸桿菌科埃希菌屬的模式種。埃希菌個(gè)種。大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c屬除大腸埃希菌外，新近發(fā)現(xiàn)有非脫羧埃希菌等道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸埃希菌，表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染，即可能污染腸道病原體。大腸埃希菌除普通大腸埃希菌外尚有致病性大腸埃希菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸埃希菌。用4甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基質(zhì)試驗(yàn)檢查大腸埃希菌是一項(xiàng)新技術(shù)，其檢驗(yàn)步驟為：增菌培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種MUG蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，多數(shù)情況下不需要從混合菌中分離單個(gè)菌，如MUG、試驗(yàn)為陽(yáng)性或陰性即可報(bào)告結(jié)果。原理：利用目標(biāo)菌限定酶作用的

41、底物的水解產(chǎn)物，產(chǎn)生顏色或熒光反應(yīng)作為指示系統(tǒng)來(lái)鑒定目標(biāo)菌。2儀器、設(shè)備及用具2.1無(wú)菌室參照細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)2.1.1 。2.2凈化工作臺(tái)。2.3培養(yǎng)箱（36±1）。2.4高壓蒸汽滅菌器。2.5顯微鏡（1500×）。2.6微波爐。2.7恒溫水?。?5±1 ）。2.8離心機(jī)（500-4000r/min）。2.9 0.45m±0.02m薄膜及過(guò)濾器。2.10電冰箱。2.11勻漿儀。2.12 365nm紫外燈。2.13玻璃器皿、器具參照細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)2.2.2。3試液、指示液參見(jiàn)中國(guó)藥典二部附錄。4培養(yǎng)基參見(jiàn)中國(guó)藥典二部附錄。5對(duì)照用菌液，參見(jiàn)

42、控制菌檢查5.2.6準(zhǔn)備6.1供試液的制備6.2.1液體供試品見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.1 。6.2.2固體、半固體或黏稠液供試品見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.2。6.2.3非水溶性供試品見(jiàn)細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)7.3 。6.2.4含抑菌成分供試品 供試品按常規(guī)檢查法，加入規(guī)定量的對(duì)照菌，不能檢出時(shí)，表明供試品有抑菌活性。該供試液須按以下方法之一或兩種以上方法聯(lián)合處理后，依法檢查。同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。6.2.4.1稀釋法 取規(guī)定量的供試液接種到較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。6.2.4.2離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液于無(wú)菌刻度離心管中， 3000r/min離心30

43、min，移去上清液，留底部集菌液約2ml，并稀釋該供試液至原規(guī)定量。如有不溶性藥渣，可先以500r/min離心5min，取全部上層液，再按上述方法集菌處理。6.2.4.3薄膜過(guò)濾法 取規(guī)定量的供試液于稀釋劑100ml中，搖勻，以無(wú)菌操作加入裝有直徑約47mm、孔徑不大于0.45m±0.02m微孔濾膜的薄膜過(guò)濾器內(nèi)，過(guò)濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100ml，將培養(yǎng)基加入濾器或取出濾膜，加入增菌培養(yǎng)基中。6.2.4.4中和法 取規(guī)定量含磺胺類的供試品，于 100ml增菌液（含1%對(duì)氨基苯甲酸約1-5ml）中；含砷、汞類的供試品，于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基100ml中；含洗必泰供試品，于含適量

44、聚山梨酯80等表面活性劑的100ml增菌液中（表面活性劑的用量應(yīng)預(yù)試，用量過(guò)大有抑菌作用）。6.2.4.5沉降法 取規(guī)定量供試液，自然沉降5min，取上層液于100ml增菌液中，本法適用于難溶于水的抗菌制劑。7.操作步驟7.1檢驗(yàn)程序陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn) 各供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10-100cfu，供試品和增菌培養(yǎng)基用量及檢查按供試品的各控制菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，在該供試品檢查時(shí)不必再做陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照試驗(yàn) 取稀釋劑10ml加入100ml（或200ml）相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。7.2增菌培養(yǎng)

45、取膽鹽乳糖培養(yǎng)基2份，每份各100ml。1份加入10ml供試液（相當(dāng)于供試品1g、1ml 、10cm2 ），另1份加入與供試液等量的稀釋劑作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18-24小時(shí)，必要時(shí)可延至48小時(shí)。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時(shí)在365nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的 培養(yǎng)基作本底對(duì)照。在紫外光下若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)藍(lán)白色熒光，MUG為陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG 陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照的MUG和靛基質(zhì)試驗(yàn)應(yīng)為陰性。如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供

46、試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。7.3分離培養(yǎng) 如呈現(xiàn)MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性或MUG 陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)將上述供試品 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取1-2環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18-24h。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與中國(guó)藥典二部所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。7.4純培養(yǎng) 如EMB或麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落與中國(guó)藥典二部所列特征相符或疑似者，以接種針輕輕接觸單個(gè)疑似菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑選2-3個(gè)以上疑似菌落，分別接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18-24h，作以下檢查。如平板上無(wú)單個(gè)可疑菌落，但有

47、可疑菌團(tuán)（紫黑色，或有金屬光澤），應(yīng)沾取可疑菌團(tuán)培養(yǎng)物少許，或重新取增菌培養(yǎng)液分區(qū)劃線接種于EMB瓊脂平板，培養(yǎng)18-24h，再挑選單個(gè)疑似菌落，純培養(yǎng)，作以下檢查。7.5革蘭染色、鏡檢7.5.1以接種環(huán)沾取無(wú)菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過(guò)火焰2-3次（載玻片不燙手）固定。7.5.2滴加結(jié)晶紫染液，染色1min，水洗。7.5.3滴加碘液，媒染1min，水洗，以濾紙吸干余水。7.5.4滴加95%乙醇，脫色 ，水洗。7.5.5滴加沙黃染液，復(fù)染 ，待干后，鏡檢。7.5.6染色結(jié)果7.5.6.1革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色

48、。7.5.6.2大腸埃希菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。7.5.7注意事項(xiàng)7.5.7.1玻片必須潔凈，無(wú)劃痕。涂片的菌量宜少，菌不可濃。否則，菌細(xì)胞成堆或連成片。不利菌細(xì)胞染色反應(yīng)判斷及形態(tài)觀察。7.5.7.2培養(yǎng)物的菌齡以16-24h為宜。培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，革蘭陽(yáng)性菌易染成紅色。7.5.7.3脫色是關(guān)鍵。脫色時(shí)間不足，菌細(xì)胞易染成陽(yáng)性；脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌細(xì)胞易染成陰性。7.5.7.4可用已知革蘭染色為陽(yáng)性、陰性的菌種做染色的質(zhì)量控制。8.生化試驗(yàn)8.1乳糖發(fā)酵試驗(yàn) 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)18-24h，觀察產(chǎn)酸（指示劑為酸性品紅者為紅色；指示劑為溴麝香草酚藍(lán)者為黃色），

49、產(chǎn)氣（小倒管內(nèi)有氣泡，氣泡無(wú)論大小）。為避免遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)生假陰性，亦可接種 乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于出現(xiàn)陽(yáng)性?；蜻m當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。8.2靛基質(zhì)試驗(yàn)（I） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24-48h，沿管壁加入靛基質(zhì)試液數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)試管，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。98%的大腸埃希菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽(yáng)性，一般24h即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。常以無(wú)菌操作先從管中取出1ml或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng)24h，作靛基質(zhì)試驗(yàn)。8.3甲基紅試驗(yàn)（M） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于培養(yǎng)

50、液中加入甲基紅指示液2-3滴（約每1ml培養(yǎng)液加指示液1滴），輕微搖動(dòng)，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。8.4乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)（VP）取上述斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48±2h，于2ml培養(yǎng)液中加入。萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀試液0.4ml，充分振搖，在4h（通常在30min）內(nèi)出現(xiàn)紅色判為陽(yáng)性，無(wú)紅色反應(yīng)為陰性。8.5枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C） 取上述斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2-4天，培養(yǎng)基斜面有菌苔生長(zhǎng)，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色時(shí)為陽(yáng)性，培養(yǎng)基顏色無(wú)改變、無(wú)菌苔 生長(zhǎng)為陰性。9.結(jié)果判定9.1當(dāng)陰性對(duì)照

51、試驗(yàn)呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)MUG呈陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，供試品MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。9.2MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性、IMViC試驗(yàn)為-+-、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌；MUG 陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性、IMViC 試驗(yàn)為+-、革蘭陰性桿菌，報(bào)告1g或1ml供試品檢出大腸埃希菌。9.3供試品培養(yǎng)物檢查不符合9.2中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g或1ml供試品未檢出大腸埃希菌。9.4當(dāng)陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)或陽(yáng)性對(duì)照未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)但非大腸埃希菌，不能做出檢驗(yàn)報(bào)告。10.注意事項(xiàng)10.1MUG法不必從混合菌中

52、分離單個(gè)菌落。除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽(yáng)性球菌、桿菌和芽孢菌，其MUG為陽(yáng)性。因此，在MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉的量，可排除革蘭陽(yáng)性菌的干擾。至于志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出亦判為不合格。10.2配制MUG培養(yǎng)基時(shí)，務(wù)必校正PH值，滅菌后PH不得過(guò)7.4，否則PH值偏高，MUG分解，本身則顯熒光；分裝MUG培養(yǎng)基的試管應(yīng)挑選，試管、蛋白胨不得顯熒光。10.3培養(yǎng)時(shí)間 供試品培養(yǎng)液接種于MUG培養(yǎng)基中，一般培養(yǎng)5h和24h要觀察是否產(chǎn)生熒光，如熒光很微弱，不能準(zhǔn)確判斷時(shí)，可延長(zhǎng)培養(yǎng)至48h再觀察結(jié)果。由于大腸埃希菌

53、各菌株間的GUD的活性不完全相同，對(duì)底物濃度反應(yīng)的差異；培養(yǎng)基中選擇因子的影響；培養(yǎng)時(shí)間、溫度；PH值的改變；大量競(jìng)爭(zhēng)菌和樣品本身物質(zhì)成分的干擾等，對(duì)結(jié)果的判斷亦有影響。10.4結(jié)果觀察 取供試品的MUG試驗(yàn)管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)在366nm紫外燈下觀察，陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)有較強(qiáng)的藍(lán)白色熒光，陰性對(duì)照管無(wú)熒光。供試品MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細(xì)觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），適當(dāng)傾斜試管。如陽(yáng)性對(duì)照管熒光強(qiáng)烈，影響供試品管與陰性對(duì)照管的觀察時(shí)，亦可移去陽(yáng)性對(duì)照管。10.5藥品中污染的大腸埃希菌，易受生產(chǎn)工藝及藥物的影響。在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上的菌落形態(tài)特征時(shí)有變化，挑取可

54、疑菌落往往憑經(jīng)驗(yàn)，主觀性較大，務(wù)必挑選個(gè)以上菌落分別做IMViC試驗(yàn)鑒別，挑選菌落越多，檢出陽(yáng)性菌的機(jī)率越高，如僅挑選一個(gè)菌落做IMViC試驗(yàn)鑒別，則易漏檢。10.6在IMViC試驗(yàn)中，以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。切勿將培養(yǎng)基帶入枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，以免產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間，原訂為2天，根據(jù)試驗(yàn)資料，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)3天后，枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)產(chǎn)生陽(yáng)性。僅培養(yǎng)2天是不夠的，故試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間改為2-4天。10.7以IMViC試驗(yàn)來(lái)判斷大腸埃希菌屬中的大腸埃希菌是含混的，有可能把埃希菌屬的其他種判為大腸埃希菌。IMV

55、iC試驗(yàn)為+-者，除大腸埃希菌外，還有非活躍大腸埃希菌、弗格森埃希菌、赫爾曼埃希菌。IMViC試驗(yàn)為-+-者，除大腸埃希菌外，還有非活躍大腸埃希菌、傷口埃希菌、蟑螂埃希菌。10.8在各類供試品中檢測(cè)大腸埃希菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗(yàn)。檢出的大腸埃希菌及其他控制菌培養(yǎng)物須保留1個(gè)月，備查。10.9生化試驗(yàn)也可采用商品化的自動(dòng)分析儀器進(jìn)行、儀器可以給出菌種的鑒定結(jié)果，做相應(yīng)報(bào)告。第四部分：大腸菌群1.簡(jiǎn)述 大腸菌群是指37生長(zhǎng)時(shí)能發(fā)酵乳糖，在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌。符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬等菌屬的菌種

56、。大腸菌群包括了正常人畜腸道內(nèi)的全部需氧的革蘭陰性桿菌。以大腸菌群作為衛(wèi)生指示菌比大腸埃希菌具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。因此，國(guó)際上以大腸菌群作為藥品、食品、飲水等的衛(wèi)生指示菌，對(duì)衛(wèi)生質(zhì)量的要求更嚴(yán)格。大腸菌群的檢查通過(guò)增菌、分離、革蘭染色、鏡檢和確證試驗(yàn)等步驟。2.儀器、設(shè)備及用具（見(jiàn)大腸埃希菌）。3.試液、指示液（見(jiàn)大腸埃希菌）。4.培養(yǎng)基參見(jiàn)現(xiàn)行中國(guó)藥典二部5.對(duì)照用菌液（大腸埃希菌，同控制菌方法驗(yàn)證5.2）。6.操作步驟6.1操作程序供試品供試液膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣EMB或MaCI平板乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸產(chǎn)氣報(bào)告6.2增菌培養(yǎng) 取不少于10ml膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，加入1:10供試液

57、1ml（含供試品1g或0.1ml）； 稀釋的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）和1:1000稀釋的供試液1ml(含供試品0.001g或0.001ml ）。取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基10ml管，加入稀釋劑1ml作為陰性對(duì)照。均培養(yǎng)18-24h小時(shí)，觀察結(jié)果。加供試液的膽鹽乳糖發(fā)酵管若無(wú)菌生長(zhǎng)、或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則判該管未檢出大腸菌群。若膽鹽乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)進(jìn)一步分離培養(yǎng)。6.3分離培養(yǎng) 將上述產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中的培養(yǎng)物，分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18-24h小時(shí)。大腸菌群的菌落在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上呈紫黑、紫紅、紅或粉紅色，圓形，扁平或凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上呈鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無(wú)芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)有上述菌落形態(tài)特征或疑似菌落，且為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。6.4確證試驗(yàn) 從上述分離平板上挑選4-5個(gè)疑似菌落，接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng) 小時(shí)24-48h。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判